脑脊液miRNA-451表达水平与老年糖尿病大鼠学习记忆功能的相关性
时间：2022-12-08 08:15:03 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
张伟杰，詹家奇，朱炳旺，张伟生，涂文劭，郑晓春
随着人口老龄化趋势的发展，其相关内分泌疾病——老年糖尿病(diabetes mellitus,DM)的发病率呈逐年上升的趋势，成为严重影响患者生活质量、增加家庭和社会负担的重要代谢紊乱性疾病。研究发现，DM代谢异常可引发全身各系统严重的并发症，除了直接损伤周围神经外，血糖波动异常可能增加DM患者罹患认知功能障碍的风险[1-2]，该类患者临床早期多表现为记忆和学习能力下降[3]，尤其在老年患者中已成为一个不容忽视的医学和社会问题。但其发病机制至今尚未完全明确，也缺乏有效的预防和治疗方法。
近年，研究发现，miRNA-451抑制剂可通过增强腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)的活性，从而抑制糖氧剥夺所诱导的内皮细胞程序性坏死[4]，通过靶向上调miRNA-451的表达可加重帕金森病(Parkinson’s disease，PD)小鼠认知功能障碍的发生和发展[5]。而老年DM患者学习记忆功能障碍发展至晚期更易发生阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)或PD。据此，笔者推断miRNA-451的表达水平与老年DM相关学习记忆功能障碍的严重程度密切相关。
本研究拟通过建立老年DM大鼠模型，探讨miRNA-451的表达水平与老年DM相关学习记忆功能障碍严重程度之间的关系，以期为进一步揭示老年DM相关学习记忆功能障碍发生和发展的机制提供理论和实验依据。
1.1 材料
1.1.1 实验动物 选择18～20月龄的雄性SD清洁级大鼠40只，体质量(375±75)g，由福建医科大学动物实验中心提供[动物许可证号：SYXK(闽)2016-0010]。大鼠12 h/12 h昼夜适应性喂养1周，采用电刺激方法，筛选出反应灵敏的大鼠，测定空腹血糖，以空腹血糖为4～6 mmol/L作为入选标准。
1.1.2 主要试剂 链脲菌素(streptozotocin，STZ)、柠檬酸和柠檬酸钠(厦门泰京生物技术有限公司)；
生物化学制品磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)(厦门鹭隆生物科技发展有限公司)；
miRNA Purification Kit试剂盒(中国康为世纪公司)。
1.1.3 仪器和设备 Morris水迷宫(KW-MWM，南京卡尔文生物科技有限公司)；
动物行为视频跟踪分析系统(上海吉量软件科技有限公司)；
Biosystems 7500实时聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)系统及SDS软件2.1版(Applied Biosystem，美国Thermo公司)。
1.2 方法
1.2.1 构建老年DM大鼠模型 采用高糖高脂饲料喂养(含10%猪油、20%蔗糖、2.5%胆固醇、1%胆酸盐)1个月诱导胰岛素抵抗，期间自由饮水，1个月后禁食禁饮24 h，向腹腔内注射用柠檬酸-柠檬酸钠溶液溶解稀释的STZ 35 mg/kg，注射后12 h恢复原饮食方案，3 d后测定空腹尾静脉血糖浓度，超过≥16.7 mmol/L 即为建模成功。
1.2.2 分组 符合入选标准的老年大鼠连续进行Morris水迷宫训练3 d，每日4次。Morris水迷宫训练结束后，将老年大鼠随机分为两组：(1)对照组(C组)10只，采用普通饲料喂养，自由饮水，喂养1周称取体质量并记录，而后禁食禁饮24 h，根据体质量向腹腔内注射与实验组相同浓度的等容量柠檬酸-柠檬酸钠溶液，注射完毕后继续普通饲料喂养3 d。(2)实验组(T组)30只，均为建模成功的老年DM大鼠，根据成模后高血糖持续时间进一步随机分为3个亚组，即T1(1周)、T2(3周)和T3(6周)亚组，每个亚组10只，分别继续高糖高脂饲料喂养1、3和6周。
1.3 测定指标
1.3.1 Morris水迷宫测试评估学习记忆能力 Morris水迷宫直径150 cm，高度60 cm，水深40 cm。水中加入适量牛奶，使水池呈现不透明的乳白色。将直径12 cm的圆柱形实验平台置于任一象限的中间水面下1 cm，水温保持在23～25 ℃。将大鼠面朝池壁分别从4个入水点放入水池，记录大鼠从入水到找到并站上水下隐蔽平台所需的时间，作为潜伏期。大鼠找到平台后，让其在平台上站立10 s。若大鼠入水后120 s仍未找到平台，则由实验员将其轻轻从水中引导上平台，并停留10 s，然后进行下一次训练。每只大鼠从4个入水点分别放入水池为一次训练，2次训练间隔30 s。连续训练3 d，每日4次。大鼠Morris水迷宫测试采用动物行为视频跟踪分析系统记录和分析：(1)定位航行实验，将各组大鼠从同一入水点放入水池，观察和记录大鼠寻找到平台的路线图和所需时间，即为潜伏期时间。(2)空间探索实验，定位航行实验结束后，撤去平台，将各组大鼠从同一入水点放入水池中，观察和记录120 s内的运动轨迹和穿越原平台位置的次数。
1.3.2 miRNA提取 每组大鼠完成Morris水迷宫测试后处死取脑脊液(cerebrospinal fluid,CSF)0.1 mL冻存。选用miRNA Purification Kit试剂盒提取miRNA。室温下解冻CSF样品，取200 μL CSF样品，加入5倍体积TRIzon Reagent反复吹打，使蛋白核酸复合物完全分离，离心5 min，取上层无水相于离心管中，加入1/3无水乙醇，过柱，洗柱2次。向吸附柱RS中加入700 μL Buffer RWT，离心后弃废液，重新向吸附柱RS中加入500 μL Buffer RWT，离心后弃废液，重复2次，向得到的吸附柱中间部位加入30～50 μL RNase-Free Water，离心后收集miRNA液，-80 ℃ 保存备用。
1.3.3 荧光实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测 根据miRNA cDNA Sythesis Kit逆转录试剂盒说明书进行RT-PCR检测。采用RT-PCR仪扩增目的基因片段，反应条件：95 ℃预变性10 min→95 ℃变性10 s→56 ℃复性1 min，共40个循环。设计miRNA-451的反转录引物和RT-PCR扩增序列(5’-3’)(PCR检测时上下游引物成对)引物如下，miRNA-451相对表达量用2-△△Ct表示。每个样本独立实验3次。
内参U6：
反转录引物：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’
RT-PCR引物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’
miRNA-451：
反转录引物：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACTCAC-3’
RT-PCR引物：5’-AACATTCAACCTGTCGGTGAGT-3’
2.1 Morris水迷宫测试前大鼠血糖水平比较 与C组比较，T组各亚组的血糖均升高，差别均有统计学意义(P<0.05)；
T组各亚组组内比较，差别均无统计学意义(P>0.05，表1)。表明老年DM大鼠建模成功且血糖浓度稳定，具有可比性。
2.2 大鼠Morris水迷宫测试结果、运动轨迹及CSF中miRNA-451相对表达量比较 与C组比较，T组各亚组逃避潜伏期时间显著延长、穿越原平台次数显著减少、miRNA-451相对表达量显著增加，组间比较差别均有统计学意义(P<0.05)；
T组各亚组组内比较，随着DM持续时间的延长，各亚组逃避潜伏期时间显著延长、穿越原平台次数显著减少、miRNA-451相对表达量显著增加，差别均有统计学意义(P<0.05)。具体见表1及图1。各组大鼠Morris水迷宫运动轨迹见图2。
表1 各组大鼠空腹血糖、Morris水迷宫测试结果及CSF中miRNA-451相对表达量比较Tab.1 Comparisons of fasting blood glucose,Morris water maze test results and relative expression of miRNA-451 in CSF in each group
A：逃避潜伏期时间；
B：穿越原平台次数。与C组比较，☆：P<0.05；
与T1组比较，▲：P<0.05；
与T2组比较，#：P<0.05。图1 Morris水迷宫测试结果Fig.1 Test results of Morris water maze
图2 各组大鼠Morris水迷宫运动轨迹Fig.2 Morris water maze motion trajectory of rats in each group
2.3 Pearson相关性分析结果 CSF中miRNA-451表达水平与Morris水迷宫测试成绩中的逃避潜伏期的相关系数r值为0.997(>0.8)，两者显著正相关(P=0.003)；
与穿越原平台次数相关系数r值为-0.975(<-0.8)，两者显著负相关(P=0.025)。
研究表明，与DM患者认知功能障碍密切相关的年龄为60～80岁[6]。此年龄段患者常伴有其他基础疾病，导致临床症状隐匿，诊断较为困难。因此，通过寻找灵敏度和特异度较高的指标来诊断该类患者的早期认知功能障碍及严重程度，是目前国内外研究的热点。
miRNA是由21～23个核苷酸组成的单链非编码RNA，存在于机体各种体液中，包括CSF、唾液和血液等，可与mRNA结合沉默基因的转录，从而发挥生物学效应。既往研究证明，血清miRNA可作为疾病相关的诊断和预后标记物，如AD诊断标准和血管损伤生物标志物相组合可增加AD的敏感性和特异性[7]。miRNA-451是一种多功能的miRNA，目前证实其在很多方面均具有重要作用，例如血液系统疾病、神经发育、心血管疾病等方面[5]。大量研究数据显示，巨噬细胞移动抑制因子(macrophagemigration inhibitor factor，MIF)可能是miRNA-451一个重要的靶标基因[8]。miRNA-451通过靶向负性调控MIF基因的表达，抑制脑微血管内皮细胞的增殖、迁移能力以及血管形成能力，从而造成血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的损伤，导致BBB渗透性增加。临床影像学研究表明，PD患者基底节区BBB渗透性增加[9]。
本研究结果显示，随着老年DM大鼠高血糖持续时间的延长，其水迷宫潜伏期时间逐渐延长，目标象限穿越次数逐渐减少，表明维持长期高血糖状态下，老年DM大鼠的学习记忆力开始下降并逐渐加重。既往研究发现，DM前期的人群，大约42%在4 a 内发生认知功能下降，大约54%在8 a内发生血管性痴呆[10]，表明随着DM病程的进展，其对中枢神经系统认知功能的损害程度逐渐加重，本研究结果与之一致。为进一步探索其发病机制，本研究通过收集和分析DM持续过程的不同时间点CSF中miRNA-451 表达水平发现，其增加的程度与老年DM大鼠学习记忆功能损害的严重程度变化趋势相关，进一步采用Pearson相关性分析发现，两者之间成显著正相关关系，表明长期高血糖状态可诱发中枢神经系统miRNA-451表达水平增加，进而导致认知功能下降。推测与长期高血糖诱发miRNA-451表达升高，并通过抑制MIF的表达抑制细胞增殖、迁移和血管生成，从而导致老年DM大鼠BBB损伤有关，这可能是引起老年DM相关血管性认知功能损害的重要机制。
MIF是集细胞因子、生长因子、激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子，能够阻止巨噬细胞从毛细血管中促炎迁移，在中枢神经系统和周围神经系统行使重要的作用。陈嘉宁等[11]研究显示，通过下调miRNA-451表达，增加MIF的表达对PD模型小鼠中枢神经系统多巴胺能神经元和海马区细胞具有明显的保护作用，这种保护作用可有效改善PD小鼠认知功能障碍。本研究发现，随着DM病程的进展，C、T1、T2和T3 4组大鼠CSF中miRNA-451的表达水平逐渐上升，大鼠的认知功能障碍程度逐渐加重，表明随着DM持续时间的增加，miRNA水平的上升在一定程度上抑制MIF的表达，造成DM大鼠神经系统多巴胺能神经元和海马区细胞的损伤。进一步研究发现，当MIF被活化后可通过激活下游IL-8、VCAM-1和ICAM-1等细胞因子的表达升高调节血管新生[12]。在促进新生微血管生成方面，MIF呈剂量依赖性上调21个内皮细胞血管生成基因，特别是VEGF165和Smadl基因的表达，这是MIF参与大血管病变、DM相关的微血管病变、血管新生等过程的重要机制[13]，这些调节机制与老年DM相关认知障碍中关于脑微血管损伤导致的学习记忆功能障碍的理论依据一致。因此，可推测，在miRNA-451参与DM患者早期认知功能障碍损伤的机制中，miRNA-451表达的动态变化在预测老年DM相关学习记忆功能障碍的发生和发展中具有重要的临床意义。但本实验未进一步探讨miRNA-451下游分子的变化情况，将在今后进一步研究。另外，该结论是否也适用于老年DM患者，需在今后临床工作中进一步验证。
综上所述，随DM持续时间的延长，老年DM大鼠的学习记忆功能障碍逐渐加重，其严重程度与CSF中miRNA-451表达水平的升高程度成正相关。miRNA-451可能通过抑制MIF的表达，抑制细胞增殖、迁移和血管生成等机制导致老年DM大鼠BBB损伤，从而引起老年DM相关血管性认知功能损害。
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