SBA-15固定化酶的研究进展
时间：2022-12-04 20:40:25 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
冉帆凡，李露
（1.青岛科技大学海洋科学与生物工程学院，山东 青岛 266042；
2.青岛科技大学化工学院，山东 青岛 266042）
酶是一种多功能催化剂，在最佳条件下具有高特异性和催化活性[1-2]，在大规模实际生产中拥有巨大的潜力。然而酶的低稳定性、难以回收和重复利用等缺点阻碍了其在工业催化生产中的应用。为了克服这些缺点，通常对酶作固定化处理[3-5]。
固定化酶通常指将酶附着在适当的载体表面或内部并且保持活性，再将其加入反应体系的一项技术，是酶工程中酶催化应用的主流，已广泛应用于各个领域[6-8]。固定化酶不仅拥有酶的催化特性，还能降低酶对环境变化的敏感性（温度、pH值），提升酶的回收性和重复使用性，从而提高生物催化效率，减少催化过程的成本，为实际生产应用提供更多的选择[9-12]。
固定化方法和载体是保持固定化酶优良性能的关键。固定化载体的选择要依据酶和载体的性质、空间结构、应用目标等[13]。迄今为止，传统的载体材料包括无机材料、有机材料、复合材料三大类。无机介孔材料因其稳定性强、成本低、纯度高、无菌性、化学惰性等优点在众多固定化载体中脱颖而出[14]。根据国际纯粹与应用化学联合会（International Union of Pure and Applied Chemistry，UPAC）命名法，介孔材料被定义为孔径在2 nm～50 nm的纳米结构[15-16]。其中，介孔硅基分子筛SBA-15具有比表面积大、孔隙结构规则明确、孔径分布窄且易调整、结合金属原子能力强、合成条件温和等优点，被认为是固定化酶的理想载体[17-19]。近年来，越来越多的学者制备了不同形状、孔径、比表面积的SBA-15作为固定化酶的载体，这些载体均展示出优良的催化性能。本文综述了介孔硅基分子筛SBA-15固定化酶的研究进展和实际应用，以期对其未来的深入开发研究提供理论支持。
SBA-15固定化酶的方法可以分为物理法和化学法两大类，其中物理法包括吸附法和包埋法，化学法包括共价结合和交联法，表1列举了4种固定化方法的优缺点。
表1 SBA-15固定化酶方法比较Table 1 Comparison of SBA-15 immobilized enzyme methods
1.1 物理吸附
物理吸附法是SBA-15固定化酶最简单和使用最多的固定方法，它通过SBA-15表面和酶分子表面的次级键的相互作用（范德华力、疏水作用、离子键等），将酶黏附在载体基质表面[20]。在温和的吸附条件下，酶通常能最大程度的地保留完整的结构和活性。
通过物理吸附法，SBA-15固定化酶可以保持较高的活性和热稳定性。夏峰[21]通过物理吸附法将漆酶成功固定在SBA-15的孔道内，在pH3、给酶量48 mg/g时固定化漆酶表现出最佳活性。经8批次反应后剩余活性仍能达到85%以上，具有较好的操作稳定性。孟繁蓉等[22]将α-淀粉酶固定在SBA-15介孔材料上，分别测试固载前后的酶学性质。结果显示，与游离酶相比，固定化酶的热稳定性、储存稳定性及重复使用性都得到明显提升。
物理吸附过程易受载体、酶分子及外界环境因素的影响，溶液pH值、温度以及作为支撑的固体材料的特性都有可能影响吸附效率。
1.1.1 孔径对SBA-15固定化酶效果的影响
有研究表明，SBA-15的孔径大小可直接影响固定化酶的吸附量。庄凯等[23]采用物理吸附法将葡萄糖氧化酶固定在SBA-15上，考察了SBA-15孔径对酶吸附量的影响。研究发现，SBA-15的孔径和水热温度呈线性关系。当水热温度达到145℃时，葡萄糖氧化酶的吸附量达到最大值128 mg/g，此时孔径为8.77 nm。这是因为葡萄糖氧化酶分子形态大小约为8 nm，当SBA-15孔径在8 nm附近时有利于酶进入载体中。芮银[24]研究了不同孔径的SBA-15对固载乙酰胆碱酶的影响。研究显示，介孔材料SBA-15孔径在12.5 nm时，载酶量最高可达250 mg/g，远高于孔径在6.1 nm时的载酶量（85 mg/g）。Matsuura等[19]制得孔径分别为 5.4 nm和10.6 nm的介孔材料SBA-15（孔径为5.4 nm）、SBA-15（孔径为10.6 nm），评估了孔径对SBA-15吸附大肠杆菌谷氨酰胺酶YbaS的影响。结果显示，SBA-15（孔径为10.6 nm）具有更高的热稳定性，且吸附量是SBA-15（孔径为5.4 nm）的3倍。这表明固定化效率和热稳定性很大程度上取决于SBA-15的孔径，SBA-15（孔径为5.4 nm）上的酶分子暴露在孔径入口周围，易受外界环境影响导致酶变性。相比之下SBA-15（孔径为10.6 nm）上的酶分子附着在孔道内，能够有效保护蛋白质从而增加固定效率和热稳定性。
上述研究表明，SBA-15孔径能够直接影响固定化酶的效果。当孔径小于酶分子大小时，酶分子难以进入载体内只能附着于表面而导致吸附量较低；
反之孔径过大时，酶分子在吸附过程中易脱落，也无法得到较高的吸附量。因此将SBA-15的孔径控制在与酶分子形态大小接近时最为理想。
1.1.2 载体形态对SBA-15固定化酶效果的影响
研究显示，固定化载体的形态同样能够影响吸附率。Kingchok等[25]合成了球状和3种棒状形态的介孔硅SBA-15，研究了SBA-15的形态对细胞色素C的吸附作用和相对活性的影响。结果表明，与棒状SBA-15固定化酶相比，球状SBA-15更有助于底物进入活性位点，从而产生更高的活性和催化效率。
1.1.3 pH 值和等电点（isoelectric point，PI）对 SBA-15固定化酶效果的影响
蛋白质的吸收主要受静电吸附作用的控制，溶液pH值和酶分子等电点pI会影响酶与载体间的静电作用，进而影响吸附效果。庄凯等[23]研究了溶液pH值对SBA-15固定化酶的影响。结果表明，在pH4.0时SBA-15载酶量达到顶峰92 mg/g。这是因为酶与载体的等电点相近时，静电吸附作用较强。Chong等[26]使用孔径为10 nm的SBA-15固定阿魏酸酯酶（ferulic acid esterase，FAE），在5～9的pH值范围内检测6种重组菌FAE的固定化效率。结果显示，有80%～90%的蛋白质在5～7的pH值范围内被有效固定。在pH 9时，所有阿魏酸酯酶的固定化效率都下降到20%。
综上，SBA-15物理吸附法固定化酶避免了化学修饰对酶分子构象的影响，最大程度保留了酶活，从而提高催化性能。SBA-15的孔径、溶液pH值、酶分子等电点pI等会影响固定化效果。然而，仅靠较弱的范德华力等物理力量不足以将酶牢牢结合在载体上，一些环境因子如高温、pH值可能会削弱键的作用力，进而导致酶保留时间缩短、重复使用次数减少[27]。
1.2 包埋法
包埋法是将酶固定在聚合物材料的网格结构或微囊结构等多空隙载体中。包埋法将酶包埋在载体内，同时允许底物等小分子自由出入，底物仍能渗入空隙与酶接触并与之反应。Takimoto等[28]利用不同孔径的SBA-15介孔材料通过包埋法固定纤维素酶，结果显示酶分子成功固定在SBA-15载体上，固定化效率随孔径增大而增加。
1.3 共价结合
为了减少酶脱落的现象，需要增强酶和载体间的连接力，常用方法是采用共价结合对酶进行固定化[29]。酶与载体的共价偶联通常需要几个步骤来实现，首先是载体的功能化，然后酶偶联到活化的载体上，最后去除多余的和未结合的分子。
1.3.1 表面化学修饰
对SBA-15功能化处理不仅使催化剂再生，而且展示出更优异的催化性能。在众多功能化液体中，董姝婷[30]选择3-氨丙基-3-乙氧基硅烷[（3-aminopropyl）triethoxysilane，APTES]对 SBA-15进行氨基修饰制得NH2-SBA-15，并对胰蛋白酶进行固定化。结果显示氨基化后的NH2-SBA-15不仅载酶量有所提高，且在不同温度、pH值环境下的稳定性也有所提高。Zhong等[31]采用16种有机硅烷化合物对SBA-15硅烷化改性，制得功能化的SBA-15负载根瘤菌脂肪酶（rhizobium lipase，RL）并研究其酶学性质。结果显示，与游离酶和未修饰的SBA-15相比，功能化的SBA-15固定化酶降低了对pH值的敏感性，且有机基团为RML耐高温和保护酶构象不受破坏提供了微环境，从而提高了固定化酶热稳定性。
1.3.2 离子液体修饰
关于二氧化硅负载离子液体应用于催化反应的研究逐渐深入，离子液体可通过阳离子共价结合到二氧化硅表面[32]，因其优异的导电性、稳定性、非挥发性等，成为最具吸引力的修饰剂之一。Xiang等[33]成功利用羧基功能化离子液体（carboxyl-functionalized ionic liquid，CIL）结合SBA-15作为桥接剂与壳聚糖（chitosan，CS）复合形成了新型纳米复合材料SBA-CILCS，并将其应用于固定猪胰脂肪酶的研究。研究结果显示，固定化酶的吸附率可达到132.1 mg/g，且具有良好的活性、操作稳定性和重复利用性。Bian等[34]用离子液体（onic liquids，RTIL）修饰SBA-15用于木瓜蛋白酶的固定化，发现修饰后的RTIL-SBA-15负荷量显著高于未修饰的SBA-15，说明离子液体能够促进木瓜蛋白酶的共价结合。同时，在酪蛋白水解中，固定在RTIL-SBA-15上的木瓜蛋白酶也表现出更优异的活性，这意味着离子液体有利于提高固定化木瓜蛋白酶的活性。Zhong等[35]采用离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐修饰SBA-15后负载南极假丝酵母脂肪酶，与SBA-15直接固定化酶相比，离子液体修饰后的固定化酶活性显著提升且有较高的甘油解能力。
介孔硅基材料SBA-15与酶分子通过化学反应形成共价键固定化酶，这种固定化方法是不可逆的，且固定化效果牢固，不易洗脱，提高了固定化酶的稳定性和负载量。
1.4 交联法
交联法是在酶分子和交联试剂之间形成共价键从而达到固定化酶的目的。Dai等[36]采用重复冻融循环法合成了菠萝皮羧甲基纤维素/聚乙烯醇/SBA-15水凝胶复合材料，通过吸附-交联的方法固定木瓜蛋白酶。与游离木瓜蛋白酶相比，水凝胶复合材料固定化酶显示出更高的pH值敏感性、活性、热稳定性和储存稳定性。
介孔硅基分子筛SBA-15孔径可调、壁厚、比表面积大且稳定性高，在各领域有巨大的应用潜力。近年来，SBA-15固定化酶生物催化因其具有绿色环保、节约成本和资源符合可持续性战略发展等优势被广泛应用于生物质能源、生物传感器、高分子化合物降解等各大领域。
2.1 生物基化学物质的制备
生物催化是合成生物基化学物质的首选途径。与化学方法相比，生物催化带来了更明显的优势，例如反应条件温和（通常在30℃～60℃下进行）且不产生副产物，因此制备绿色的活性生物催化剂在工业生产中极为重要[37]。
2.1.1 生物柴油的生产
作为可再生能源，生物柴油被认为是同时解决能源安全与环境保护的可行途径之一[38]。使用生物酶催化技术制备生物柴油具有反应条件温和、副产物（甘油）纯度高、废水处理要求低、对环境影响较小等优点[39-40]。现阶段研究中，通常使用脂肪酶催化甘油三酯羧酯键的水解，但在水活性低的反应条件下，脂肪酶可以催化醇的羧酸酯化，或催化羧酸酯的转酯化[41]。Katiyar等[42]采用物理吸附法将制备的SBA-15用于固定红色念珠菌脂肪酶，利用所获得的固定化酶作为催化剂，催化棉籽油与甲醇进行酯交换反应制备生物柴油。结果表明，在反应温度为40℃、棉籽油与甲醇摩尔比为6∶1、固定化酶的质量分数为5%的条件下反应68 h，脂肪酸甲酯的产率可达（98±2）%。Pinto等[43]探究了介孔材料SBA-15固定脂肪酶以催化棕榈仁油生成脂肪酸乙酯。结果显示，固定化酶具有良好的催化性能。其中，物理吸附法制备的催化剂能更有效地进行酯交换反应，催化剂表观收益率均＞90%，乙酯转化率均＞98%。
2.1.2 甘油二酯的制备
天然油脂中甘油二酯（diacylglycerol，DAG）含量较低，可通过酶促甘油解法制备DAG[44]。酶促甘油解法是指在酶催化下，将甘油和三酰甘油（triacylglycerols，TAG）催化生成DAG的方法。寇毛毛[45]分别使用不同基团修饰的SBA-15固定化磷脂酶（lecitaseultra，LU），并将其用于大豆油甘油解反应制备DAG的催化反应。结果显示，不论修饰与否的SBA-15固定化酶均能催化甘油解反应，且修饰后的固定化酶具有更优异的重复使用性。其中，在优化C5H13N-SBA-15-LU催化甘油解的最佳条件下，TAG转化率最高可达（93.84±0.71）%。Wang等[46]将介孔材料SBA-15经过卤素和卤烷烃修饰后分别固定化南极假丝酵母脂肪酶、米曲霉脂肪酶、磷脂酶、米黑根霉脂肪酶，再将其用于催化大豆油的甘油解反应。结果显示，固定化酶均能有效地催化生成DAG。其中，固定化米黑根霉脂肪酶的甘油解性能最好，TAG转化率达到了71.47%～89.41%，DAG质量分数含量达到了52.79%～59.22%。
2.1.3 生物乙醇的生产
生物乙醇是一种可再生生物燃料资源，通常被用作汽油添加剂，以增加辛烷值以及减少CO排放[47]。一般来说，生物乙醇的生产过程包括预处理（第一次水解）、糖化（第二次水解）、解毒、发酵和分离。然而，生物乙醇生产的重要步骤是水解过程，因为在这一步骤中需要使用高成本的酶[48]。Wongvitvitchot等[49]将里氏木霉酶分别固定在MCM-48、TUD-1和SBA-15载体上，研究不同载体的固定化效率。结果显示，SBA-15固定化酶吸附性能最高，能达到100%，因此选择SBA-15固定化木霉酶用于纤维素的水解。在纤维素水解的最佳条件下，使用1.2 g固定化酶水解3 d能得到90%的糖。即使循环使用3次，固定化酶仍然具有较高的催化效率，这表明SBA-15固定化木霉酶在工业应用上具有一定的潜力。
2.2 生物传感器
生物传感器是一种能将生物信号转变为电信号的传感器，多用于食品安全和农产品检测。常见的生物传感器通过固定在电极上的酶和底物反应前后产生的电流信号变化得出酶被抑制的程度，抑制程度和农药浓度在一定浓度范围内呈线性相关，因此可以检测出农药残留[50]。芮银等[24]对合成的SBA-15氨基化修饰制得NH2-SBA-15，再用吸附-交联法将乙酰胆碱酶（acetylcholine enzyme，AChE）固定在上述载体，得到AChE-NH2-SBA-15。农药可以抑制AChE的活性，因此可以用固定化酶分别检测有机磷和氨基甲酸酯类农药。结果显示，与游离酶相比，固定化酶在农药检测的灵敏度、线性范围和检出限方面均表现出更好的效果。向固定化酶中添加一定量的农药进行检测，检测出的农药回收率为94%～103%，且相对标准偏差＜5%，说明检测准确，误差小。
2.3 环境保护
木质纤维农业废弃物作为陆地植物中第二丰富的生物废弃物，是很有前景的天然、低成本、可再生和持久性原料[51]。木质纤维素利用的第一个主要步骤是预处理，旨在通过降解木质素成分和降低纤维素结晶度来增加纤维素和半纤维素的可及性[52]。Sadeghian-Abadi等[53]以SBA-15固定化漆酶用于木质素的降解。研究结果显示，在孵育12 h后，固定化酶能够有效地将木质素以可溶形式去除，脱木质素效率可达91%。固定化酶也能够去除从木质素中释放出来的酚类化合物，使用SBA-15固定化漆酶降解木质素4 h后从上清液中去除了30%以上的酚类化合物，12 h后固定化漆酶仅保留10%的酚类物质。
Qiu等[54]以羧基功能化离子液体为桥接剂，将无机材料SBA-15与壳聚糖结合，得到的纳米复合材料固定化漆酶并用于酚类污染物的去除。漆酶将2，4-二氯苯酚氧化成活性自由基，聚合形成二聚体，使其在水中的溶解度和毒性降低，从而更容易从水中分离。结果显示，固定化酶能有效地除去酚类污染物，去除率最高可达到90%。
目前，SBA-15固定化酶已涉及医药、食品、能源、生物清洁等多个领域。随着介孔材料的研究不断深入，SBA-15固定化酶的研究愈加成熟。尽管如此，SBA-15固定化酶仍留存一些问题需要解决：（1）仅靠较弱物理吸附的作用力不足以将酶牢牢固定在载体上，且固定化酶易受外界环境因素影响发生解吸附；
（2）对SBA-15功能化处理步骤繁琐，成本较高，且一定程度上损失了酶活，限制了其在工业上的广泛应用；
（3）现阶段的研究集中在SBA-15固定化单酶上，而将其应用于多酶偶联催化反应较少。因此，仍需要深入研究或创造新型固定化载体和方法，实现多酶的有序连接，在保证酶活性的前提下稳固酶和载体的连接力，降低生产成本以满足实际工业需求。
