明胶改性水凝胶在骨再生与修复中的应用
时间：2022-12-03 14:45:04 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
石秀梅 董 默 高 原 赵若晗
1.牡丹江医学院药学院，黑龙江牡丹江 157011；
2.牡丹江医学院医学影像学院，黑龙江牡丹江 157011；
3.深圳大学附属华南医院，广东深圳 518111；
4.牡丹江医学院科研共享平台，黑龙江牡丹江 157011
创伤性骨折、骨肿瘤切除和先天性畸形导致的严重骨缺损不太可能自我再生与修复。临床上通常用自体骨移植或用同种（或异种）异体骨移植来使骨缺损得到再生与修复，前者会造成供体新的损伤，在应用中受到一定限制，后者虽可使骨源问题得到缓解，但有免疫排斥和传播疾病的风险，因此治疗骨缺损的再生与修复材料备受关注。明胶（gelatin，Gel）来源于胶原，作为天然生物高分子材料，其具有生物可降解性、良好的生物相容性和凝胶性、成本低等优点，是一种传统药用辅料[1-2]，近年来在骨再生与修复中得到广泛应用。本文对明胶改性水凝胶在骨再生与修复中的研究现状进行综述。
明胶改性水凝胶能促进骨缺损的再生与修复。Kanda等[3]将从猪皮的酸性和碱性溶液中提取的明胶加工成多孔水凝胶海绵体，将直径小于或大于500 μm，且具有互连结构的圆盘植入大鼠颅骨缺损部位。8周后，只有小孔隙酸性提取物诱导骨形成（超过60%），尽管再生骨的胶原取向仍不成熟，但说明其能够在体内诱导原位骨形成。Kim等[4]通过向成骨细胞培养基中添加明胶，开发了一种新的成骨细胞片技术。通过显微镜和组织学观察明胶诱导的成骨细胞片（gelatin on osteogenic cell sheet，GCS）与传统的成骨细胞片（osteogenic cell sheet，OCS）的形态，GCS比OCS更厚、更强。通过DNA定量，GCS比OCS显示出更高的细胞增殖率。分别通过实时定量聚合酶链反应和茜素红S染色来评估成骨基因标志物的表达和钙沉积的数量，GCS比OCS的骨形态发生蛋白-7 mRNA表达显著上调，GCS和OCS在第10天均表现出负自主复制序列反应性，但只有GCS在第21天表现出正自主复制序列反应性。研究表明细胞片技术能有效地将活细胞输送到病灶区域。
明胶改性水凝胶虽然能促进骨再生与修复，但也存在一些不足，如再生骨的胶原取向仍不成熟、短期呈负自主复制序列反应性等，使其应用受到限制。
通过改性改善明胶性能、获得新的性质，提高其在骨再生与修复中的效果。再生医学的转化研究集中在三种主要方法：细胞疗法、蛋白质疗法和人工材料疗法，这些方法预计将越来越受欢迎。
2.1 细胞疗法
细胞疗法是利用患者自体的成体细胞对组织、器官进行修复的治疗方法。这些细胞在骨缺损的再生与修复中作为种子，达到成骨效果。常见的种子细胞有骨髓间质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSC）、基质细胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）、富含血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）等。
2.1.1 BMSC将脱钙骨基质（decalcified bone matrix，DBM）粉末与一定比例羟基磷灰石（hydroxylapatite，HAP）及Gel制备成骨微环境仿生支架。取BMSC，接种于合适浓度比例的HAP/DBM/Gel支架上，研究证实该支架具有良好的细胞相容性及成骨诱导活性[5]。Xue等[6]采用大鼠截骨术模型，发现BMSC与橙皮素/明胶海绵支架复合可加速体内骨折愈合。张淦等[7]在兔双侧桡骨中段制作骨缺损，再将双前肢放入人工海水中浸泡3 h，制成海水浸泡开放性骨缺损模型，研究发现纳米HAP或β-磷酸三钙/Gel/BMSC联合高压氧均能修复该缺损，并且前者效果优于后者。
2.1.2 SDF-1近年来，研究发现SDF-1在骨再生与修复过程中发挥重要作用。明胶/透明质酸盐（hyaluronate，HA）共聚物与HAP和SDF-1混合，制备Gel/HA-HAP和Gel/HA-HAP/SDF-1两种复合材料。采用大鼠髁骨缺损模型，对这些复合材料的生物相容性和聚集BMSC的能力进行研究，Gel/HA-HAP具有生物相容性并且对大鼠没有全身毒性，Gel/HA-HAP和Gel/HA-HAP/SDF-1均显示出较好的成骨性，后者显示出更快的骨生长趋势。将Gel/HA共聚物与硫酸钙、HAP和SDF-1混合制备复合材料，其骨再生增强。
2.1.3 PRP研究发现明胶/β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate，β-TCP）海绵具有骨传导性、孔隙结构、机械强度和生物降解性，并提供生长因子的控制释放。用Gel/β-TCP海绵与PRP（A组）、单独使用海绵（B组）和空白（C组）治疗30只兔尺骨骨缺损。8周后，微计算机断层扫描图像显示A组骨缺损被新骨填充，并且未显示骨缺损两端的桡尺融合，而在其他两组中观察到桡尺融合；
A组的骨密度显著高于其他组；
A组的组织学图像显示，骨缺损两端皮质骨连续，髓腔形成。为了探讨由壳聚糖（chitosan，CS）、Gel和PRP组成的CS/Gel/PRP复合材料对大鼠双侧桡骨缺损的愈合潜力，研究者将40只大鼠双侧制造桡骨缺损，并随机分成8组：空白组、自体移植组、CS组、Gel组、CS/PRP组、Gel/PRP组、CS/Gel组和CS/Gel/PRP治疗组，研究表明自体骨移植组和CS/Gel/PRP组的新骨形成、骨组织和软骨组织密度、骨体积和力学性能均显著高于其他组。
研究者将PRP与米诺环素或巨噬细胞等联用于治疗骨缺损，取得了很好的效果，进一步拓宽了其在骨再生与修复中的应用[8-10]。还有研究者将人牙周膜干细胞、脂肪干细胞、碱性成纤维细胞生长因子、促红细胞生成素等种子植入明胶水凝胶支架形成复合材料，研究其对骨再生与修复的影响，为临床应用提供了有力的证据[11-16]。
2.2 蛋白质疗法
蛋白质疗法的种子包括蛋白质和肽，其被加载到水凝胶支架中，通过控制释放来提高骨再生与修复能力。常见的种子有骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）等。
2.2.1 BMPBMP有同源二聚体和异源二聚体，BMP-2属于同源二聚体，BMP 2/7属于异源二聚体。有研究者发现含有BMP-2的明胶海绵和含有BMP-2的Gel/β-TCP海绵均能明显地诱导骨再生。也有研究者将BMP-2与其他蛋白质（如膜辅蛋白）、细胞或自体骨髓等联合应用于治疗骨再生与修复，结果表明联合释放增强了成骨细胞的募集和血管生成，对骨再生产生协同效应。BMP-2在骨缺损的再生与修复中研究较多，而BMP 2/7也具有潜在的应用价值[17-18]。
2.2.2 CGRP研究者将CGRP与水凝胶支架等交联用于治疗骨缺损。Wu等[19]通过三维打印技术制备了由介孔生物活性玻璃、海藻酸钠（sodium alginate，Alg）和明胶组成的新型缓释水凝胶支架，以柚皮苷或CGRP为种子药物，通过直接印刷或表面吸附制备载药支架，结果显示该支架具有较高的孔隙率（约80%），具有相互连通的立方孔结构、较强的生物活性和生物相容性；
柚皮苷或CGRP在长达21 d的时间内表现出稳定的缓释行为；
用其培养的MG-63细胞显示出更有效的促进细胞增殖和成骨相关基因的表达。
还有研究者将脱细胞富血小板纤维蛋白、鹿茸多肽、类胰岛素样生长因子-1、酶等种子植入明胶水凝胶支架形成复合材料，研究其对骨再生与修复的影响，结果表明这些复合材料是有前途的骨再生材料[20-21]。近年来，上述研究者将细胞疗法和蛋白质疗法联合应用于骨缺损的再生与修复，研究表明骨愈合的效果很好。
2.3 人工材料疗法
临床上，骨科填充和修复用人工材料主要包括磷酸钙盐、甲基丙烯酸甲酯（methyl methacrylate，MMA）、生物活性玻璃（bioactive glass，BG）、单质及氧化物等。
2.3.1 磷酸钙盐磷酸钙盐骨填充植入物如磷酸钙、磷酸八钙、双相磷酸钙纳米颗粒、HAP和β-TCP，已被广泛研究用于骨缺损的再生与修复。Goichi等[22]在4只比格犬下颌骨的双侧制造骨缺损，并植入单独的磷酸钙骨水泥或含有复合明胶粉末的磷酸钙骨水泥。6个月后，移除下颌骨，进行微计算机断层扫描和组织学分析，显示单独放置磷酸钙骨水泥组的新骨仅在其周围形成，很少或未长入其内部，而放置含有复合明胶粉末的磷酸钙骨水泥组观察到其内部及其周围再生的新骨。磷酸钙骨水泥的吸收量和骨再生量取决于明胶粉末与磷酸钙骨水泥的混合比例。
在研究磷酸八钙/明胶复合材料修复大鼠颅骨缺损时，进行体内和体外实验，结果均证实在合适的剂量范围内，其对骨再生过程中的血管生成具有积极作用。李明等[23]研究发现Gel/HAP与米诺环素复合材料联合钛网固定对兔股骨缺损的修复效果与自体骨的修复效果相当，并有助于减少感染发生。
2.3.2 MMA通过适当技术可将MMA与Gel复合制备甲基丙烯酸酯明胶（methacryloyl gelatin，GelMA）。将GelMA和Alg用于制备三维GelMA/Alg水凝胶，由于其高含水量和多孔结构，可以模拟天然细胞外基质的结构和生物功能。小鼠胚胎成骨细胞共培养实验表明GelMA/Alg-HAP复合水凝胶具有良好的生物相容性，有利于骨再生和骨修复。研究表明0.02% Res-SLNs/GelMA水凝胶是一种合适的Res释放系统，具有良好的生物相容性、骨传导和骨诱导性。
2.3.3 BG溶胶-凝胶工艺和静电纺丝相结合制备具有纤维微结构的明胶，再与BG混合，制备Gel/BG复合支架。与具有类似微观结构的明胶支架相比，Gel/BG复合支架的拉伸强度、断裂伸长率均有增加。将该支架浸入模拟体液中，12 h内支架表面形成了HAP样材料，放置5 d后，支架的表面完全覆盖有HAP样层，显示该支架具有生物活性。在体外培养过程中，该支架支持小鼠胚胎成骨细胞前体细胞的增殖、碱性磷酸酶活性和矿化，显示具有较好的生物相容性。研究者还发现CS/Gel支架具有良好的生物相容性和力学性能，但缺乏生物活性，经加入BG纳米颗粒使其生物活性增强。
2.3.4 单质及氧化物将非金属单质（如磷）或氧化物（如Fe3O4）与明胶等复合制成复合材料，观察对骨缺损的再生与修复效果。Huang等[24]开发了一种基于黑色磷纳米片（black phosphorus nanopatch，BPN）的水凝胶支架，其由GelMA、BPN和阳离子精氨酸基不饱和聚酯酰胺光交联而成，该支架将BPN保持在内部，包封的BPN可以降解为磷离子并捕获钙离子，从而加速骨缺损的生物矿化。研究表明通过持续供应磷而不提供外源钙有望实现加速骨再生。惠慧等[25]研究表明超顺磁性壳聚糖质粒（Fe3O4微粒/CS）明胶微球具有促进骨成血管的作用；
静磁场和振动磁场联合应用，能够明显提高超顺磁性质粒壳聚糖明胶微球局部成血管作用；
振荡磁场能有效地减少局部磁性微球的残留。该研究提出并利用该微球内部的磁性微动、营养物质交换原理，解决了骨缺损内部血管化的问题。
基于明胶改性水凝胶在骨再生与修复中的应用，通常可按下面步骤进行：①在明胶中通过特定方式加入无机成分制备出仿生材料支架，使其结构、力学和生物学等特性与天然骨组织相似，并具有成骨性，因此明胶改性水凝胶支架的制备成为关键；
②通过将支架与种子（细胞、蛋白质、人工材料等）进行复合（也可不复合），为了提高细胞的活性，可将其置于特定的三维力学微环境下。经相关生物学特性检测证实，基于明胶改性水凝胶有利于细胞的增殖及迁移，并有骨相关基因的表达；
③制备骨缺损的动物模型，对植入物检测相关基因，最终证实明胶改性水凝胶复合物对骨缺损的再生与修复具有良好的成骨效果。
