绿色木霉菌株发酵液及分生孢子悬浮液对南方根结线虫二龄幼虫活性的影响

谈韫 樊航 张紫瑶 李玉平 周晓馥

摘要：为研究绿色木霉（Trichoderma viride）菌株对南方根结线虫（Meloidogyne incognita）二龄幼虫（J2）活性的影响，采用不同浓度绿色木霉菌株发酵液（简称发酵液）和绿色木霉分生孢子悬浮液（简称孢子液）触杀二龄幼虫（J2），分别在24、36、48 h测定发酵液和孢子液对二龄幼虫（J2）致死效果。以5%阿维菌素乳油5 000倍液和无菌水为对照，同时对幼虫形态特征变化进行显微观察，探究发酵液和孢子液触杀二龄幼虫（J2）的原因，并通过盆栽试验对发酵液、孢子液预防和防治南方根结线虫的效果进行评价。结果表明，孢子液杀线过程主要依靠分生孢子的寄生作用，孢子寄生于幼虫体腔和体壁，幼虫活力随着孢子生长而降低;发酵液杀线过程主要依靠绿色木霉真菌在发酵过程中产生的拮抗物质。48 h内发酵液处理和孢子液处理中幼虫校正死亡率最高达86%和71%，均对幼虫具有较强致死效果，高于阿维菌素对照（51%），发酵液杀线效果和作用时效均优于孢子液。在盆栽试验中，绿色木霉发酵液和孢子液对南方根结线虫的预防效果分别为60.00%和49.99%，防治效果分别为66.67%和47.62%，生防作用显著。绿色木霉菌株对南方根结线虫的生防效果研究具有很高应用价值，为生物防治植物根结线虫病提供了良好的理论基础和研究依据。

关键词：南方根结线虫;绿色木霉;致死效果

中图分类号：
S432.4+5文献标志码：
A

文章编号：1002-1302（2022）12-0114-07

收稿日期：2021-09-07

基金项目：吉林省科技发展计划（编号：20190301059NY）;中央指导地方科技发展资金吉林省基础研究专项（编号：202002016JC）。

作者简介：谈 韫（1996—），男，甘肃兰州人，硕士研究生，主要从事植物遗传学研究。E-mail：554979397@qq.com。

通信作者：周晓馥，女，博士，教授，博士生导师，主要从事植物分子生物学研究。E-mail：zhouxiaofu@ jlnu.edu.cn。

根结线虫（Meloidogyne）是一种杂食性植物病原线虫，被列为全球十大植物寄生线虫之首[1]。其寄主范围广，致病性强，在二龄幼虫（J2）时期可寄生于植物根部通过口针吸取植物根部营养，导致植物的根部形成不均等的球状根瘤，使植物地上部吸收营养困难，出现叶片发黄、植株矮化等问题[2-3]。根结线虫入侵造成的伤口，使土壤中其他病原物的侵入更加容易，形成复合性病害，每年对我国农副产品造成大量减产等严重经济损失[4-5]。

南方根结线虫（Meloidogyne incognita）是垫刃目（Tylenchida）异皮科（Heteroderidae）根结线虫属（Meloidogyne）植物寄生线虫，是我国分布最广的根结线虫之一。由于根结线虫极难防治，目前对于南方根结线虫的防治仍以化学手段为主，因其高毒、高污染、残留药物难降解等特性，部分化学药剂被禁用或限制使用[6-7]。即使是市面最常使用的生物类杀虫剂阿维菌素乳油，虽然能有效杀死线虫，但过多稀释会导致杀线效果减退，浓度过高会对人体健康和生态坏境造成影响，远不能满足市场的需求[8-9]。随着绿色环保的农业发展需要，运用安全高效的生物防治手段就愈发重要，多方生物防治技术也成为将来主要防治研究方向。

木霉属真菌（Trichodema spp.）是丝孢纲（Hyphomycetes）丝孢目（Moniliales）丛梗孢科（Moniliales）木霉属（Trichoderma）在自然界廣泛分布的一种生防真菌，通常存在于土壤环境和植物根系[ 10]。研究发现，木霉菌对根结线虫具有拮抗作用，可产生拮抗物质或通过寄生作用达到防治根结线虫的效果[10-12]。绿色木霉（Trichoderma aviride）作为应用最广的木霉菌之一，具有促进植物生长、使用安全、价格低廉等多种优点[13-14]。目前，木霉菌在对根结线虫的生防研究方面已经取得了重要的进展，但绿色木霉对植物根结线虫病的防治效果相关研究还不完善，本研究将对绿色木霉菌株发酵液及分生孢子悬浮液对南方根结线虫二龄幼虫（J2）活性的影响进行探究，进一步为绿色木霉在植物根结线虫病防治方面提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

绿色木霉菌株（Trichoderma viride）由吉林省植物资源科学与绿色生产重点实验室分离鉴定保存，南方根结线虫（Meloidogyne incognita）卵块由农业应用技术北京市重点实验室分离鉴定，北京农学院王绍辉教授惠赠。

1.1.1 绿色木霉分生孢子悬浮液的制备

在培养7 d绿色木霉的PDA平板上中加入5 mL无菌水充分振荡，使绿色木霉分生孢子脱落在无菌水中，即得到绿色木霉分生孢子悬浮液（简称Tvs），采用血球计数板计数孢子液的浓度（浓度为1.6×107 CFU/mL），并稀释成1.6×106 CFU/mL;3.2×105 CFU/mL;1.6×105 CFU/mL（简称Tvs10;Tvs50;Tvs100）3个梯度的浓度备用。

1.1.2 绿色木霉发酵液的制备

取配制好的绿色木霉孢子悬浮液2 mL加入含有100 mL PDB培养基250 mL三角瓶中，黑暗振荡培养7 d（28 ℃，180 r/min），后采用灭菌的滤纸滤去发酵液中的菌丝团、孢子等即得到绿色木霉发酵液（简称：Tv），并稀释10、50、100倍得到3个浓度（简称：Tv10，Tv50，Tv100）放入4 ℃冰箱，保存备用。PDB培养基配方：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1 000 mL，pH值为7。

1.1.3 南方根结线虫的活体培养

将番茄种子（番茄品种为常丰中蔬四号）浸泡在50 ℃温水中3～5 h，采用1% NaClO溶液消毒，洗净后放入装有少量温水的培养皿中（下垫1层滤纸防止种子淹死），在28 ℃培养箱中催芽至种子露白。将露白番茄种子播种至装有灭菌的草炭土和蛭石1 ∶1塑料钵中，待番茄发育到4～5真叶时在距离植株根部约1.5 cm处用1 mL移液器枪头打4个约2 cm深的小孔，每孔接种1 000条南方根结线虫二龄幼虫。

1.1.4 南方根结线虫二龄幼虫（J2）悬浮液的制备

挑取接种南方根结线虫植株根系的淡黄色卵块浸泡在1% NaClO溶液中5 min，洗净后置于灭菌的培养皿中，加入少量无菌水，26 ℃恒温培养箱中黑暗培养3 d，逐天收集孵化的二龄幼虫，计数，加无菌水配制成10 000 条/mL的二龄幼虫（J2）悬浮液，放入4 ℃冰箱保存备用。

1.2 绿色木霉发酵液和分生孢子悬浮液直接杀线作用

向灭菌的96孔细胞培养板中依次加入100 μL南方根结线虫二龄幼虫（J2）悬浮液（1 000条）、不同浓度的绿色木霉孢子悬浮液和绿色木霉发酵液100 μL，同时设置加100 μL无菌水的空白对照和加100 μL 5%阿维菌素乳油5 000倍液对照，共10个样本，3次生物学重复，置于26 ℃恒温培养箱中黑暗培养，分别在24、36、48 h采用体态法（活动弯曲的线虫代表存活，僵直的线虫代表死亡）统计南方根结线虫二龄幼虫死亡情况，并校正其死亡率。

线虫死亡率=（死亡线虫数/供试总线虫数）×100%;

校正死亡率=（处理线虫死亡率-空白对照线虫死亡率）/（1-空白对照线虫死亡率）×100%。

1.3 盆栽试验

1.3.1 绿色木霉发酵液和分生孢子悬浮液对南方根结线虫的预防作用

将黄瓜种子（黄瓜品种为津研四号）播种在营养土中，待出苗后移栽至填装无菌土的盆中，每盆无菌土2 kg，2株苗。移苗 7 d 后在黄瓜植株根系周围施入绿色木霉发酵液（Tv）和孢子悬浮液（Tvs）15 mL，同时设置施加清水和5%阿维菌素乳油5 000倍液作为对照，共4组处理，3次生物学重复。施入绿色木霉15 d后在距离每棵黄瓜植株根部约1.5 cm处采用1 mL移液器枪头打2个约2 cm深小孔，每孔接种1 000条南方根结线虫二龄幼虫（J2）。接种线虫30 d后统计根结数，计算根结减退率，评价发酵液和孢子液对南方根结线虫的预防效果，种植期间适量补充水分。

1.3.2 绿色木霉发酵液和分生孢子悬浮液对南方根结线虫的防治作用

移苗前处理同“1.3.1”节。移苗7 d后在距离每棵黄瓜植株根部约1.5 cm处采用1 mL移液器枪头打2个约2 cm深的小孔，每孔接种1 000条南方根结线虫二龄幼虫（J2）;接种线虫15 d后在黄瓜植株根系周围施入绿色木霉发酵液（Tv）和孢子悬浮液（Tvs）15 mL，同时设置施加清水和5%阿维菌素乳油5 000倍液作为对照，共4组处理，3次生物学重复。施入绿色木霉30 d后统计根结数，计算根结减退率，评价发酵液和孢子液对南方根结线虫的防治效果，种植期间适量补充水分。

参考Bridge等的方法[3]对根结进行分级：0级，无根结，根系健康;1级，有不明显的小根结，且根结之间不连接，占总根系1%～10%;2级，有明显的小根结，有些根结之间相互连接，占总根系的11%～30%;3级，有明显的大根结，部分侧根发生畸变，占总根系31%～50%;4级，主侧根出现大量根结，部分主侧根发生畸变，占总根系51%～75%;5级：根结大且密集，大部分根结相互连接，多数主测根发生畸变，占总根系76%以上。

盆栽试验时间：2021年5月6日至6月28日;试验地点：吉林师范大学吉林省植物资源科学与绿色生产重点实验室。

根结指数=∑（各级病株数×相对应根结分级）/（该处理组调查总株数×最高级别数）×100;

预防效果（防治效果）=（对照根结指数-处理根结指数）/对照根结指数×100%;

根结减退率=（对照组根结数-处理组根结数）/对照组根结数×100%。

1.4 数据处理

数据均运用SPSS 5.0软件分析处理，邓肯氏（Duncans）法进行差异显著性检验（α=0.05）。

2 结果与分析

2.1 南方根结线虫二龄幼虫（J2）在绿色木霉发酵液和孢子悬浮液中形态特征变化的分析与比较

绿色木霉发酵液和孢子悬浮液中南方根结线虫二龄幼虫（J2）形态变化的镜检显示，初期不同处理加入新孵化的幼虫时，幼虫活性较高，行动不受影响。由图1可知，0～24 h分生孢子及菌液发酵物逐渐发挥作用，部分幼虫身体逐渐僵直、行动迟缓、头部口器和身体中发现少量孢子，身躯周围也被少量孢子团所包围。与孢子液处理不同，发酵液处理组中还出现大量被菌丝缠绕的幼虫，由于菌丝缠绕致使幼虫无法脱离，限制其活动能力。24～48 h镜检发现，孢子液处理中出现许多僵直死亡的幼虫，幼虫口器和身体内可以清晰发现大量的孢子，并且躯干中部被大量孢子包围，一些孢子寄生于幼虫体内和体壁上，整个虫体还被大量孢子团和菌丝团所包裹，幼虫身躯麻痹，生命力极低，一些寄生在幼虫体内的孢子萌发出少量菌丝穿透体壁。发酵液处理中死亡幼虫尾部出现溶解现象，躯干并无孢子寄生和缠绕，体内流出大量孢子和器官，虫体相对完整。接下来72 h观察中，孢子液处理中被孢子寄生的虫体在寄生部位发生溶解现象，虫体分解成断裂的几部分，无法保持完整形态。

综上，绿色木霉孢子悬浮液对根结线虫二龄幼虫（J2）的作用主要依靠分生孢子的寄生作用，孢子从幼虫口器进入虫体内部，寄生于体腔，外部孢子寄生于幼虫体壁，幼虫活力随着孢子生长而降低，虫体最终也被溶解成分裂的几段。相较于孢子悬浮液处理，发酵液处理组由于孢子和菌丝被滤除，孢子较少，死亡的幼虫大多虫体完整，寄生现象少，证明绿色木霉真菌在发酵过程中会产生使二齡幼虫（J2）致死的拮抗物质，其作用发生过程中使幼虫尾部溶解，从体腔内流出组织和体液，导致幼虫死亡。

2.2 绿色木霉发酵液对南方根结线虫二龄幼虫（J2）活性的影响

2.2.1 4 h不同浓度发酵液对南方根结线虫二龄幼虫（J2）活性的影响

24 h二龄幼虫（J2）在5%阿维菌素乳油5 000倍液对照与发酵液处理中校正死亡率分别高达36.78%和58.03%，与无菌水对照相比幼虫死亡数显著增大（P<0.05），证明发酵液能够对幼虫起到良好的致死效果，由表1可知，24 h杀线效果优于阿维菌素。

2.2.2 36 h不同浓度发酵液对南方根结线虫二龄幼虫（J2）活性的影响

由图2-A可知，36 h 4个浓度发酵液处理，二龄幼虫（J2）死亡数均显著大于无菌水处理，杀线效果显著。幼虫在发酵液（Tv）中校正死亡率（73.32%）显著大于阿维菌素处理（44.84%）（P<0.05）。此时，发酵液（Tv）杀线效果远好于5%阿维菌素乳油5 000倍液。10倍稀释液杀线效果（45.36%）和阿维菌素对照不显著，提示在36 h，10倍稀释液杀线效果已和阿维菌素相近，4个浓度发酵液处理幼虫校正死亡率Tv>Tv10>Tv50>Tv100。

2.2.3 48 h不同浓度发酵液对南方根结线虫二龄幼虫（J2）活性的影响

由图2-B可知，在48 h发酵液（Tv）杀线效果（86.21%）和10倍发酵液稀释液杀线效果（73.74%）无显著差异，提示发酵液杀线效果接近峰值。50倍和100倍稀释液对幼虫致死率与阿维菌素对照（50.66%）无显著差异，二龄幼虫（J2）校正死亡率Tv>Tv10>Tv50>CK2>Tv100，呈现明显梯度关系，在0～100倍稀释浓度范围内，浓度越高杀线效果越好。

综上，由图3-A可知，绿色木霉发酵液对南方根结线虫二龄幼虫（J2）有良好的致死作用， 校正死亡率在48 h内最高可达86%，效果要好于阿维菌素处理的51%，不同浓度的发酵液对应二龄幼虫（J2）死亡率呈明显的线性关系，在0～100倍稀释浓度范围内，幼虫死亡率随浓度升高而上升。

2.3 绿色木霉孢子悬浮液对南方根结线虫二龄幼虫（J2）活性的影响

2.3.1 4 h不同浓度孢子液对南方根结线虫二龄幼虫（J2）活性的影响

由表2可知，24 h南方根结线虫二龄幼虫（J2）在5%阿维菌素乳油5 000倍液对照与Tvs处理（1.6×107 CFU/mL）中校正死亡率分别为36.78%和27.98%，Tvs<CK2，阿维菌素杀线效果优于孢子液。不同浓度孢子液处理中幼虫死亡数与无菌水对照相比无显著差异，提示在24 h不同浓度孢子液对幼虫活性影响不显著。

2.3.2 36 h不同浓度孢子液对南方根结线虫二龄幼虫（J2）活性的影响

由图4-A可知，在36 h，Tvs处理（1.6×107 CFU/mL）和Tvs10处理（1.6×106 CFU/mL）的幼虫死亡数显著大于无菌水对照，Tvs50 和Tvs100处理（3.2×105、1.6×105 CFU/mL）的幼虫死亡数杀线效果显著（P<0.05），提示在36 h不同浓度孢子液开始对南方根结线虫二龄幼虫（J2）活性有影响。

2.3.3 48 h不同浓度孢子液对南方根结线虫二龄幼虫（J2）活性的影响

由4-B可知，在48 h，Tvs（1.6×107 CFU/mL）的杀线效果（70.56%）和Tvs10（1.6×107 CFU/mL）的杀线效果（70.11%）无显著差异，显著大于幼虫在Tvs50（3.2×105 CFU/mL）和Tvs100（1.6×105 CFU/mL）的校正死亡率（45.09%、38.20%）（P<0.05）。幼虫在4个浓度孢子液的校正死亡率Tvs>Tvs10>Tvs50>Tvs100，提示48 h幼虫校正死亡率在孢子液浓度3.2×105～1.6×107 CFU/mL范围内呈梯度关系，孢子浓度越高杀线效果越好。孢子浓度低于3.2×105 CFU/mL时对线虫活性影响不大。

综上，绿色木霉分生孢子悬浮液对南方根结线虫二龄幼虫（J2）有良好的致死作用，校正死亡率在48 h内最高可达71%，效果要好于阿维菌素处理的51%。0～24 h幼虫活性与孢子液浓度无关，24～48 h 幼虫死亡率在孢子浓度 3.2×105～1.6×107 CFU/mL 范围内呈梯度关系，随着浓度升高，对线虫致死率越高。

2.4 绿色木霉发酵液和孢子悬浮液触杀南方根结线虫二龄幼虫（J2）作用时效分析

2.4.1 发酵液触杀南方根结线虫二龄幼虫（J2）作用时效分析

由图5-A可知，在0～48 h相同浓度发酵液处理下，二龄幼虫（J2）校正死亡率随时间增长呈明显上升趋势，在48 h达到各个处理最高值。0～24 h内二龄幼虫（J2）在绿色木霉发酵液（Tv）处理中校正死亡率增长最高，致死效果最强;24～48 h内校正死亡率增长平稳上升，趋于平缓。10、50、100倍稀释液在0～24 h 对二龄线虫（J2）致死效率增长低于24～48 h，发酵液浓度越低在 0～48 h内对二龄幼虫（J2）致死效率增长越缓慢，可能是由于发酵液浓度越低导致对南方根结线虫二龄幼虫（J2）活性产生影响的拮抗物质越少，对二龄幼虫（J2）致死作用发挥时间越长。在 48 h 发酵液（Tv）和10倍稀释液对二龄幼虫（J2）活性影响无显著差异，提示在48 h绿色木霉发酵液对南方根结线虫二龄幼虫（J2）的活性影响已接近峰值（86.21%）。

2.4.2 孢子液触杀南方根结线虫二龄幼虫（J2）作用时效分析

由图5可知，在0～24 h，相同浓度孢子液处理下二龄幼虫（J2）校正死亡率随时间的增长呈缓慢上升趋势，24～36 h内二龄幼虫（J2）在Tvs（1.6×107 CFU/mL）和Tvs10（1.6×106 CFU/mL）中校正死亡率增长最高，孢子液在此时段对幼虫触杀效果最好。36～48 h二龄幼虫（J2）在Tvs10（1.6×106 CFU/mL）和Tvs（1.6×107 CFU/mL）中校正死亡率无显著差异，且在Tvs（1.6×107 CFU/mL）中校正死亡率保持较高水平，提示48 h孢子液对二龄幼虫（J2）触杀效果达到顶峰（70.56%）。可能是由于綠色木霉孢子对南方根结线虫二龄幼虫（J2）寄生作用主要是发生在24～36 h，在此时段，效果最好。

2.5 绿色木霉发酵液和孢子悬浮液对南方根结线虫盆栽试验的预防效果

由表3可知，在盆栽预防试验中，清水对照处理的黄瓜植株根结大、数量多，密集分布于整个根系，根系粗糙，平均根结数为153.67个，显著高于其他处理组，绿色木霉发酵液和孢子液处理的黄瓜植株根系洁白，较光滑，根结小且数量少，平均根结数量为30.00个和34.00个，两者的根结指数（33.33和41.67）相较于清水对照显著降低。发酵液和孢子液对南方根结线虫的预防作用明显，预防效果分别达60.00%和49.99%，均高于阿维菌素对照处理的45.00%，且2个处理中根结减退率分别为79.38%和77.48%，高于阿维菌素对照（66.13%），提示绿色木霉发酵液和孢子悬浮液能够对根结线虫起到良好的预防作用，且效果略优于阿维菌素。

2.6 绿色木霉发酵液和孢子悬浮液对南方根结线虫盆栽试验的防治效果

由表4可知，在盆栽防治试验中，清水对照处理的黄瓜植株根系根结大而密，遍布整个根系，占整体根系约70%，平均根结数为167.67个，显著高于其他处理组（P<0.05），被严重侵染，绿色木霉发酵液处理的黄瓜植株根系光滑洁白，根结小且数量少，仅占整个根系的10%，平均根结数量为29.00个，显著少于清水对照和阿维菌素对照（73.67）（P<0.05），根结指数为29.16，提示受线虫侵染程度较轻。发酵液和孢子液对南方根结线虫的防治作用显著，防治效果分别达66.67%和47.62%，高于阿维菌素对照处理的38.09%，且2个处理中根结减退率分别为66.21%和60.02%，高于阿维菌素对照（54.97%），提示绿色木霉发酵液和孢子悬浮液能够对根结线虫起到良好的防治作用，发酵液显著优于阿维菌素，而孢子液和阿维菌素防效相当。阿维菌素防治效果偏低原因可能是稀释倍数过大，导致防效不理想。

3 结论与讨论

木霉属真菌作为自然界广泛存在具有生防作用的真菌，在农业、植物病虫害防治和環境治理领域具有广阔应用前景[12]。研究表明，木霉菌对根结线虫具有多方面生防机制，Sahebani等研究发现，木霉菌可产生可挥发抗生物质从而起到生防作用[15];Sharon等发现，绿色木霉可产生拮抗物质杀死根结线虫[16];Mallikharjuna等和Smith等研究表明，绿色木霉通过产生几丁质酶等细胞壁降解酶从而寄生于根结线虫虫卵或幼虫体内[17-18]。本研究中，绿色木霉菌株发酵液和孢子悬浮液均可快速高效地杀死南方根结线虫二龄幼虫（J2），48 h内线虫减退率分别达到86%和71%，进一步证明绿色木霉菌株具有稳定的防治效果。同时，通过对比发现，绿色木霉菌株发酵液和孢子悬浮液与5%阿维菌素乳油 5 000 倍液的防治效果存在显著差异，可能原因是阿维菌素稀释倍数过大，导致对线虫的致死效果未达到预期效果。在试验过程中还通过镜检观察了绿色木霉分生孢子对南方根结线虫二龄幼虫（J2）的寄生作用和绿色木霉菌液发酵物对二龄幼虫（J2）的拮抗作用，对二龄幼虫（J2）不同时间段不同处理显微镜下形态特征变化进行观察分析，为绿色木霉对根结线虫的寄生作用和拮抗作用提供佐证。通过绿色木霉发酵液和孢子悬浮液对南方根结线虫的预防和防治盆栽试验，进一步证明了绿色木霉在植物生长过程中对南方根结线虫的生防作用十分显著，绿色木霉发酵液和孢子液对南方根结线虫的预防效果分别为60.00%和49.99%，防治效果分别为66.67%和47.62%，具有稳定的防治效果。

绿色木霉大规模开发应用尚存在许多难题，如绿色木霉生长和繁殖受环境因素影响较大，产生的拮抗物质浓度较低、纯化困难等。因此，利用基因工程提高绿色木霉对不利环境的适应性成为研究热点，可为大规模应用绿色木霉提供保障。针对绿色木霉生物功能的开发尚不全面，未来仍需进一步进行研究。

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