虾青素对凡纳滨对虾亲虾繁殖性能、抗氧化能力和免疫功能的影响

王照欣 梁萌青 卫育良 徐后国 马 强 代 平

(1.上海海洋大学水产与生命学院，上海201306；
2.中国水产科学研究院黄海水产研究所，青岛266071)

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)属于热带型种类，具有广盐、广温性、肉质鲜美及经济价值高等特点，其产量在世界养殖虾类中名列前茅。目前，我国凡纳滨对虾亲虾主要从国外引入，但国外引种价格极其昂贵，这极大地制约了我国种虾产业。因此，提高我国自主培育亲虾的能力尤为重要[1]。沙蚕是凡纳滨对虾亲虾繁育阶段的主要生物饵料，但沙蚕的品质极不稳定，且易携带致病菌，这些病菌能够通过亲虾垂直传播，感染虾苗，使苗种成活率降低，造成经济损失[2]。而配合饲料质量稳定，不携带病菌，可避免虾苗的感染；
但是，目前市场上缺乏高质量的亲虾配合饲料，仅有的一些饲料也因存在亲虾强化阶段性腺促熟效果不理想，被认为不能完全取代沙蚕[2]。因此，研发亲虾营养强化饲料，能够在提高亲虾繁殖性能的同时，提高机体健康状况和抵御疾病的能力是亟待解决的问题之一。

虾青素是一种类胡萝卜素，其具有很强的抗氧化能力，能降低机体氧化损伤，但鱼类和甲壳类自身无法合成虾青素，只能通过摄入外界营养获得[3]。在水产领域，虾青素的研究主要聚焦于水产动物的体色、生长性能、抗氧化能力和免疫力等方面。例如，虾青素能够提高三疣梭子蟹、狮子头金鱼抗氧化能力，提高中华绒螯蟹免疫力和耐氨氮能力，促进锦鲤、斑节对虾生长，提高锦鲤和中华绒螯蟹的色泽[4-10]。近些年研究者发现，虾青素对水产动物亲体繁殖性能也有一定的促进作用[11]，但针对对虾繁殖性能的研究报道较少，迄今为止，尚未见虾青素对凡纳滨对虾亲虾繁殖性能影响的报道。基于此，本试验探讨了饲料中添加虾青素对凡纳滨对虾亲虾繁殖性能、抗氧化能力和免疫功能的影响，旨在为凡纳滨对虾亲虾配合饲料的配制提供数据支撑。

1.1 试验设计和试验饲料

试验设计了3种等氮等脂饲料，通过添加加丽素粉红(含有10%的虾青素)，使饲料中虾青素含量分别为587.46、1 073.29和1 574.57 mg/kg，依次记为低虾青素组、中虾青素组和高虾青素组。制作饲料时，先将原料经粉碎机粉碎后充分混合，然后再加入鱼油和水密封放入50 ℃烘箱1 h，取出后趁热制粒，烘干，于-20 ℃冰箱保存。试验饲料组成及营养水平见表1。

表1 试验饲料组成及营养水平(干物质基础)

1.2 试验用虾

试验用虾购自山东省潍坊市昌邑市邦普种业科技有限公司，采用12月龄亲虾，雌虾初始体重为(48.5±0.5) g，性腺未发育；
雄虾初始体重为(37.8±0.6) g。

1.3 养殖管理

亲虾养殖于直径2 m、高度1.3 m的养殖池内，养殖用水为深井海水，水温(30.0±0.5) ℃，溶氧高于7 mg/L，盐度31，pH 8.0～8.2，氨氮含量≤0.5 mg/L，亚硝酸盐含量≤0.05 mg/L。

试验开始时，选择大小均匀、体格健壮的雌雄亲虾各108尾，挑选位置接近的18个养殖池(位置相近，可以排除光照影响)，其中9个养殖雌虾、另9个养殖雄虾。将试验雌虾随机分到9个养殖池中，每组3个重复，每池12尾雌虾；
将试验雄虾随机分到9个养殖池中，每组3个重复，每池12尾雄虾。每日饱食投喂5次试验饲料，换水1次，换水量50%。营养强化12周后，采用镊烫法剪除雌虾单侧眼柄，并恢复48 h。

进入繁殖阶段，为使亲虾顺利产卵，改用饲料与鱿鱼混合投喂，每日投喂3次试验饲料和2次鱿鱼，鱿鱼的投喂量每日每池30 g，连续投喂4周。每日10:00挑选性腺成熟的雌虾(性腺饱满)放入相对应试验组雄虾池中进行自然交配，19:30检查雄虾池中雌虾交配情况，将受精成功的雌虾放入100 L产卵桶中，每虾1桶，水温28 ℃，微充氧，受精失败的雌虾则返回原池。翌日07:00，将产卵后的雌虾转移至原池，统计产卵量。将受精卵转移至孵化桶，8 h后受精卵已孵化成无节幼体，统计无节幼体数量。48 h后无节幼体变态为蚤状幼体，统计蚤状幼体数量。统计产卵量、无节幼体和蚤状幼体数量时，先混匀水体，使卵、无节幼体和蚤状幼体均匀分布于水中，用烧杯从中舀取100 mL水，统计烧杯内卵或幼体数量，重复5次并计算平均值，按照烧杯与产卵桶的比例计算出每尾虾的总产卵量、无节幼体和蚤状幼体的数量。

1.4 样品采集

养殖结束禁食24 h后，记录养殖池中亲虾存活数量，从每个养殖池中随机选取6尾亲虾，用吸水纸吸干表面水分后用电子天平称重并记录；
利用无菌注射器从腹部抽取血淋巴分装于含有等比例抗凝剂的离心管中，静置4 h，4 000 r/min离心10 min，取上清液于-20 ℃冰箱保存；
将亲虾于冰盘上活体解剖，用手术剪解剖出肝胰腺和性腺，准确称重，将性腺、肝胰腺置于液氮中速冻，后置于-80 ℃冰箱保存。

1.5 测定指标及方法

粗蛋白质含量测定采用凯氏定氮法(Kieltec-2300，FOSS，丹麦)；
粗脂肪含量测定采用索氏提取法，以石油醚作为抽提液(Foss Tecator，Hoganas公司，瑞典)；
粗灰分含量测定采用马弗炉550 ℃灼烧法。饲料虾青素含量测定采用GB/T 31520—2015方法，将样品经二氯甲烷与甲醇混合溶液提取，氢氧化钠甲醇溶液皂化，使其中的虾青素酯转化成游离态的虾青素，经C30反相液相色谱柱分离后，用配有紫外检测器的液相色谱仪(SPD-20A，岛津，日本)测定，外标法定量。

血清总胆固醇(TC，A111-1-1)、甘油三酯(TG，A110-1-1)、总蛋白(TP，A45-2)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C，A112-1-1)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C，A113-1-1)、丙二醛(MDA，A003-1-1)含量和溶菌酶(LZM，A50-1-1)、超氧化物歧化酶(SOD，A001-3-1)、过氧化氢酶(CAT，A007-1-1)、谷胱甘肽还原酶(GR，A062-1-1)、总一氧化氮合酶(T-NOS，A014-2)活性以及总抗氧化能力(T-AOC，A015-1)使用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行测定，按照说明书的要求先将血清用生理盐水稀释到测定范围，再将血清样品和试剂盒中的工作液加到酶标板中，然后放入酶标仪中设定波长测定吸光度，最后通过说明书中的公式计算出所测物质的含量或活性。

睾酮(HB1042-QT)、雌二醇(HB562-QT)、卵黄蛋白(HB580-QT)、转化生长因子-β1(TGF-β1，HB665-QT)、白细胞介素-10(IL-10，HB290-QT)和核因子-κB(NF-κB，HB399-QT)含量采用上海恒远生物科技有限公司生产的试剂盒测定，按照说明书的要求先将标准品按梯度稀释，然后在酶标包被板上加标准品和待测样品，37 ℃温育30 min，弃去液体并洗涤，加入酶标试剂，温育30 min，弃去并洗涤，再加入显色剂于37 ℃避光显色15 min，然后加入终止液，最后按说明书要求的波长依序测量各孔的吸光度，根据说明书中的公式计算出所测物质的含量。

1.6 数据处理与统计分析

利用SPSS 25.0统计分析软件对数据进行单因素方差分析和Duncan氏法多重比较，P<0.05为差异显著水平，结果数据以“平均值±标准误”表示。

计算公式如下：

存活率(survival rate,SR,%)=100×
养殖结束后池内虾总数/试验初始
放入池内虾总数；

增重率(weight gain rate,WGR,%)=100×
(末重-初重)/初重；

孵化率(hatchability rate,HR,%)=100×
无节幼体数量/产卵量；

变态率(metamorphosis rate,MR,%)=100×
蚤状幼体数量/无节幼体数量；

性腺指数(gonadosomatic index,GSI,%)=100×
卵巢质量/体质量；

肝体指数(hepatopancreas somatic index,HIS,%)=
100×肝胰腺质量/体质量。

2.1 虾青素对凡纳滨对虾亲虾生长性能的影响

由表2可知，凡纳滨对虾亲虾存活率随虾青素添加水平提高而提高，高虾青素组雌虾存活率显著高于其他2组(P<0.05)，雄虾存活率在各组之间差异不显著(P>0.05)。中虾青素组雌虾增重率和末重在各组中最高，显著高于高虾青素组(P<0.05)；
雄虾增重率和末重随虾青素添加水平提高先升高后趋于平缓，其中低虾青素组显著低于其他2组(P<0.05)。亲虾HSI在3个组之间无显著差异(P>0.05)。

表2 虾青素对凡纳滨对虾亲虾生长性能的影响

2.2 虾青素对凡纳滨对虾亲虾繁殖性能和后代质量的影响

由表3可知，3组凡纳滨对虾亲虾GSI、产卵量、血清睾酮和雌二醇含量之间均无显著差异(P>0.05)；
卵巢卵黄蛋白含量随着虾青素添加水平提高呈先升高后降低的趋势，其中，中虾青素组卵巢卵黄蛋白含量显著高于高虾青素组(P<0.05)，与低虾青素组之间无显著差异(P>0.05)。

表3 虾青素对凡纳滨对虾亲虾繁殖性能的影响

由表4可知，随着虾青素添加水平的提高，孵化率和无节幼体数量随之升高并趋于平缓，其中低虾青素组显著低于中虾青素组和高虾青素组(P<0.05)；
变态率和蚤状幼体数量随着虾青素添加水平的提高呈先升高后降低的趋势，其中中虾青素组变态率显著高于其他2组(P<0.05)，蚤状幼体数量显著高于低虾青素组(P<0.05)，与高虾青素组之间无显著差异(P>0.05)。

表4 虾青素对凡纳滨对虾亲虾后代质量的影响

2.3 虾青素对凡纳滨对虾雌性亲虾血清抗氧化指标的影响

由表5可知，随着虾青素添加水平的提高，凡纳滨对虾雌性亲虾血清GR活性先升高后趋于平缓，其中低虾青素组显著低于中虾青素组和高虾青素组(P<0.05)；
血清CAT活性随虾青素添加水平的提高有升高的趋势，其中高虾青素组显著高于低虾青素组和中虾青素组(P<0.05)；
血清T-AOC、SOD活性及MDA含量在3个组之间均无显著差异(P>0.05)，但血清T-AOC随虾青素添加水平的提高有升高的趋势，血清MDA含量随虾青素添加水平的提高有降低的趋势。

表5 虾青素对凡纳滨对虾雌性亲虾血清抗氧化指标的影响

2.4 虾青素对凡纳滨对虾雌性亲虾血清免疫指标的影响

由表6可知，凡纳滨对虾雌性亲虾血清LZM活性和TGF-β1含量随虾青素添加水平的提高有升高的趋势，其中在高虾青素组达到最高，显著高于其他2组(P<0.05)，低虾青素组和中虾青素组之间无显著差异(P>0.05)；
血清IL-10含量随虾青素添加水平的提高显著升高(P<0.05)；
血清NF-κB含量随虾青素添加水平的提高呈先升高后趋于平缓的趋势，在中虾青素组中达到最高，显著高于低虾青素组(P<0.05)，与高虾青素组无显著差异(P>0.05)；
血清T-NOS活性随虾青素添加水平的提高有降低的趋势，在低虾青素组最高，显著高于高虾青素组(P<0.05)，与中虾青素组无显著差异(P>0.05)。

表6 虾青素对凡纳滨对虾雌性亲虾血清免疫指标的影响

2.5 虾青素对凡纳滨对虾雌性亲虾血清生化指标的影响

由表7可知，凡纳滨对虾雌性亲虾血清TG和HDL-C含量在各组之间均无显著差异(P>0.05)；
高虾青素组血清LDL-C含量显著高于低虾青素组和中虾青素组(P<0.05)，低虾青素组与中虾青素组之间无显著差异(P>0.05)；
血清TP含量在高虾青素组最高，显著高于中虾青素组(P<0.05)，与低虾青素组无显著差异(P>0.05)。

表7 虾青素对雌性凡纳滨对虾雌性亲虾血清生化指标的影响

3.1 虾青素对凡纳滨对虾亲虾生长性能的影响

研究表明，虾青素不仅能提高暗纹东方鲀(Takifuguobscurus)、锦鲤(Cyprinuscarpiohaematopterus)和大黄鱼(Larimichthyscrocea)等鱼类的生长性能，而且对凡纳滨对虾、斑节对虾(Penaeusmonodon)、罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)及红螯螯虾(Chrtaxquadricarinatus)等甲壳类生长也有促进作用[6-16]。本试验结果发现，凡纳滨对虾亲虾的增重率在添加适宜水平虾青素后有显著的提高。但是，饲料虾青素水平对雌性亲虾和雄性亲虾的促生长作用上存在差异，随着虾青素添加水平的提高，雄性亲虾的增重率显著升高然后趋于平缓，而雌性亲虾的增重率呈现先升高，然后当虾青素在饲料中的含量超过1 073.29 mg/kg时，则会降低雌性亲虾的增重率，这表明在亲虾营养强化期间，适量的虾青素对亲虾的生长发育有促进作用，但雌性亲虾和雄性亲虾对饲料虾青素的需求可能存在差异。

3.2 虾青素对凡纳滨对虾亲虾繁殖性能和后代质量的影响

在亲虾培育过程中，需要特别关注亲虾的繁殖性能，包括GSI、性激素水平和产卵量，其中，GSI和性激素水平代表了性腺发育情况，GSI和性激素水平越高表示性腺发育越好；
产卵量是指每次产卵的数量，也可以直接作为评价亲虾繁殖性能的依据。已有研究发现，饲料中添加100 g/kg磷虾粉(其虾青素含量较高)的半滑舌鳎亲鱼血清雌二醇含量和相对产卵量显著高于未添加磷虾粉组的亲鱼[17]。但是，在本试验中，各试验组亲虾的GSI、产卵量及血清性激素含量随虾青素添加水平的提高没有显著的变化，可能是因为在本试验中低虾青素组的虾青素含量就可以部分满足凡纳滨对虾性腺的正常发育和雌二醇合成，而半滑舌鳎亲鱼对照组饲料中未添加富含虾青素的鳞虾粉，所以当亲鱼饲料中添加富含虾青素的鳞虾粉后提高了血清雌二醇含量和相对产卵量[3,17]。不过，也有研究发现，虾青素对雌性中华绒螯蟹的GSI没有显著影响[18]，而本研究由于考虑到亲虾繁殖中对虾青素的需求，而没有设计空白对照组，因此，虾青素是否也能提高凡纳滨对虾亲虾的GSI、性激素水平和产卵量，还有待进一步研究。卵黄蛋白是胚胎和幼体早期发育的营养来源，在卵黄发生期卵黄蛋白迅速合成积累[19]。本试验结果显示，中虾青素组雌虾卵巢卵黄蛋白含量最高，显著高于高虾青素组，与低虾青素组无显著差异，这说明适宜水平虾青素可以提高雌虾卵巢卵黄蛋白含量，但当虾青素在饲料中含量超过1 073.29 mg/kg时则会使卵巢卵黄蛋白含量降低。

受精率孵化率、幼体变态率、无节幼体数量和蚤状幼体数量能直观反映凡纳滨对虾后代的活力，经常被用在亲体繁殖的后代质量评价[20]。在本研究中，幼体的变态率和蚤状幼体数量在中虾青素组达到最高，受精卵的孵化率和无节幼体数量在高虾青素组达到最高，且与中虾青素组无显著差异。虾青素对卵和幼体质量的提高可能是因为虾青素在亲虾体内积累，通过亲虾传递给受精卵和幼体，进而减少自由基的破坏和不饱和脂肪酸的氧化，从而提高了卵和后代质量[21-22]。在其他水产动物的研究中也发现，虾青素能够提高卵和后代质量，如适量的虾青素能够提高半滑舌鳎受精卵的孵化率，促进仔鱼生长，提高仔鱼的存活率和消化酶活性，且能降低仔鱼的畸形率[23]，也能提高虹鳟鱼受精卵发眼率和孵化率[24]。

3.3 虾青素对凡纳滨对虾亲虾抗氧化能力的影响

生物体内的有氧生化反应会产生大量自由基和活性氧，这些物质会攻击体内脂质、DNA和蛋白质，造成机体损伤[21]。研究表明，虾青素具有较高的抗氧化作用，这是因为虾青素的分子结构包括1条长链共轭双键和多个羟基、酮基，这样的结构十分容易与自由基和活性氧结合，从而将其清除，达到保护机体的作用[22]。MDA含量、T-AOC、CAT和GR活性可以评价机体的抗氧化能力，其中，CAT和GR是机体氧化还原体系中的关键酶，CAT能与机体中的过氧化氢结合并将其清除，减少过氧化氢对机体的损害；
GR对血红蛋白具有保护作用、使巯基蛋白保持还原性[25]；
MDA是由脂质过氧化产生的，其含量可以反映脂质过氧化程度[23]；
T-AOC代表机体抗氧化能力的总和，包括抗氧化物质和抗氧化酶[26]。因此，以这些为评价指标，可以评价虾青素对多种水产动物抗氧化能力的作用。李美鑫等[27]研究发现，饲料中添加虾青素显著提高了乌鳢血清CAT活性，降低了血清MDA含量。Jiang等[4]也研究发现，在中华绒螯蟹幼蟹饲料中添加60～90 mg/kg天然虾青素，显著提高了血清T-AOC，降低了血清MDA含量。本试验也发现了类似的结果，凡纳滨对虾亲虾血清CAT和GR活性均随虾青素添加水平的提高而显著升高，高虾青素组血清T-AOC相比低虾青素组也升高了10.12%，而低虾青素组血清MDA含量相比高虾青素组降低了20.51%。这表明虾青素对于提高凡纳滨对虾亲虾的抗氧化能力同样具有十分重要的作用，所以在亲虾饲料中，可以通过添加适量虾青素，来提高亲虾的抗氧化能力，降低机体的氧化损伤。

3.4 虾青素对凡纳滨对虾亲虾免疫功能的影响

水产动物的养殖过程易感染多种疾病，健康问题是限制养殖业发展的重要因素之一，而虾青素已被多次证明可以提高水产动物的免疫能力[24,27]。许多水产动物疾病与炎症相关，当机体受到病原体侵害时，自身免疫系统就会启动，此时机体释放炎症因子激活更高级、更大范围的免疫细胞，对外部入侵的病原体进行杀伤和清除，同时释放的抗炎因子对炎症反应起到一定的抑制作用，防止其活性太高对自身造成伤害[20]。本试验测定了与炎症相关的细胞因子含量，包括NF-κB、TGF-β1和IL-10。其中，NF-κB是细胞中重要的转录调节因子，在炎症反应中，NF-κB能诱导产生某些促炎因子，如白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等激活免疫系统，清除病原体[28]；
而TGF-β1和IL-10是抗炎因子，两者都可以通过减少主要组织相容性复合体类抗原表达，减轻局部炎症反应[29]。T-NOS能够在体内催化产生一氧化氮(NO)，以往的研究已经证明，内毒素和某些细胞因子可诱导一氧化氮合酶催化产生大量NO，其对肠黏膜具有杀伤毒性和促炎作用，会损害机体健康[30]。本试验中，凡纳滨对虾亲虾血清NF-κB含量随虾青素添加水平的提高呈先升高后趋于平缓的趋势，血清TGF-β1和IL-10含量均随虾青素添加水平的提高而升高，而血清T-NOS活性降低，表明NO合成减少，从而可减轻对机体的刺激，促使机体清除细菌、病毒的同时减轻亲虾的炎症反应。除了上述细胞因子外，LZM在防御外源微生物入侵方面也发挥着重要的作用，其主要通过破坏细菌细胞壁中的糖苷键，使细胞破裂，致其死亡；
LZM还可与诱发炎症的酸性物质结合，减轻炎症反应[27]。本试验结果显示，随着虾青素添加水平的提高，凡纳滨对虾亲虾血清LZM活性显著升高，表明机体抵御病原体入侵的能力提高。这一点在其他研究中也被证明，例如,王军辉等[6]发现虾青素可以提高锦鲤血清LZM活性；
王慧春[2]发现饲料中添加了虾青素的凡纳滨对虾体内LZM活性显著高于未添加虾青素的凡纳滨对虾。综上所述，虾青素能够通过提高血清LZM活性，增强凡纳滨对虾亲虾抵御细菌和病毒入侵的能力，此外也通过提高了血清NF-κB、TGF-β1和IL-10细胞因子含量，从而使免疫功能得到加强。

在凡纳滨对虾亲虾饲料中添加适量虾青素可提高亲虾的抗氧化能力和机体免疫功能，显著提高受精卵孵化率、幼体变态率和卵巢卵黄蛋白含量，从而提高亲虾的繁殖性能。

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