不同时期应用复方肝素钠尿囊素凝胶对大鼠深Ⅱ度烧伤后增生性瘢痕形成的影响
时间：2023-06-29 22:50:01 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
邢 亮，冯建科，马磊磊，魏 伟，张庆富，张 涵
（河北医科大学第一医院烧伤整形科 河北 石家庄 050000）
瘢痕是皮肤受到各种创伤愈合修复后的自然反应，其异常增生可导致病理性瘢痕。病理性瘢痕可以分为很多种，包括增生性瘢痕(Hypertrophic scar，HS)、浅表性瘢痕和瘢痕疙瘩等[1]。在瘢痕的众多类型里以HS最为常见而又难以治疗，约占91.4%[2]。深Ⅱ度烧伤伤及真皮网层，因此极易发生异常增生，形成HS，给患者带来经济和心理负担，是临床烧伤科医师面临的一大难题[2]。复方肝素钠尿囊素凝胶内含洋葱提取液、肝素钠和尿囊素，具有抑制成纤维细胞的增殖、避免组织硬化、抗炎、增加瘢痕表面有弹力、减少病理性胶原过度增生和促进细胞上皮化的作用，常于创面愈合后立即应用，临床治疗作用明确，但有研究发现部分患者治疗效果并不理想[3-4]。瘢痕的增生过程可分为炎症期（肉芽组织期）、增生期、重塑期（瘢痕成熟期）3个阶段[5]。各个阶段细胞生长环境不同，药物作用效果也因应用时间不同可产生巨大的差异。本研究通过制备深Ⅱ度烧伤大鼠模型，观察不同时期应用复方肝素钠尿囊素凝胶对HS的影响，以期发现复方肝素钠尿囊素凝胶抑制瘢痕增生的最佳时间。
1.1 实验动物：选择20周龄SPF级SD大鼠50只，购于河北伊维沃生物科技有限公司[动物生产许可证号：SCXK（冀）2020-002]，雌雄不限，体重（250±50）g。分笼饲养于室温18℃～25℃、湿度50%～60%、12 h光照/12 h黑暗交替和洁净空气通风的环境中。定时喂食和更换垫料。所有的处理严格遵行《实验动物管理条例》，并在医院实验动物管理委员会监督下进行。
1.2 主要试剂与仪器：复方肝素钠尿囊素凝胶购于Merz Pharma GmbH & Co.KGaA公司、OCT冰冻切片包埋剂、伊红、苏木素、改良Masson三色染色试剂盒和中性树胶均购于索莱宝公司；
TRIZOL购于Thermo Scientific公司；
FastKing RT Kit和FastFire qPCR PreMix购于天根生化科技有限公司；
实验仪器和实验场地由河北医科大学第一医院中心实验室提供。
1.3 方法
1.3.1 实验模型制备：SD大鼠实验前1周进行适应性饲养。参照丁毅等[6]报道的方法制备模型：大鼠实验前1周进行适应性饲养，造模前1 d禁食禁水12 h。使用10%水合氯醛（0.3 ml/kg）腹腔注射麻醉，背部备皮，完全刮干净毛发后用8%硫化钠溶液脱毛，75%乙醇消毒。将砝码放到烧开的水浴锅中，煮沸10 min，用镊子将砝码垂直置于大鼠背部要烫伤的皮肤上，持续10 s后移开砝码（病理切片观察是否为深Ⅱ度烫伤），移开砝码后立即予腹腔注射5 ml生理盐水，进行抗休克治疗。病理切片证实造模成功，切片呈现：部分真皮层内细胞坏死，部分毛囊等附件残存，毛细血管扩张、管腔可见血液瘀滞及红细胞。对照组大鼠不作任何处理。见图1。
图1 两组创面皮肤病理切片（100×）
1.3.2 实验分组：根据复方肝素钠尿囊素凝胶应用时间分为14 d组（A组）、28 d组（B组）和42 d组（C组）。其中A组又分为应用前对照组（A0组，于造模第14天取材）、未应用组（A1组，于造模第14天应用凡士林，涂抹28 d后取材）、应用组（A2组，于造模第14天应用复方肝素钠尿囊素凝胶，与A1组同期取材）。B组又分为应用前对照组（B0组，于造模第28天取材）、未应用组（B1组，于造模第28天应用凡士林，涂抹28 d后取材）、应用组（B2组，于造模第28天应用复方肝素钠尿囊素凝胶，与B1组同期取材）。C组又分为应用前对照组（C0组，于造模第42天取材）、未应用组（C1组，于造模第42天应用凡士林，涂抹28 d后取材）、应用组（C2组，于造模第42天应用复方肝素钠尿囊素凝胶，与C1组同期取材）。共造模45只，每小组5只。未应用组和应用组每天固定时间在创面直径3 cm范围内均匀涂抹凡士林或复方肝素钠尿囊素凝胶3次(各凝胶涂擦量为1.0 g)。
1.3.3 创面愈合率计算：观察A组SD大鼠瘢痕组织的质地、颜色和上皮化程度，并用相机拍照。在3 d、7 d、14 d 、21 d、28 d、35 d 和42 d记录创面情况，使用Adobe Photoshop CS6和 Image-Pro Plus 6.0软件计算大鼠的愈合率。愈合率（%）=（S0-S）/S0×100%，其中S0为原始创面面积，S为未愈创面面积。创面完全愈合的标准为创面完全被上皮覆盖，无残余缺损，创面色均一光滑。
1.3.4 HE染色：收集各组瘢痕组织放入4%甲醛溶液中固定、脱水，OCT包埋后切成10μm厚的切片。苏木精染色5 min，伊红染色3 min，完成操作后将切片在Nikon显微镜下拍照，观察组织形态。镜下测量瘢痕组织以及邻近的正常组织表皮层和真皮层厚度。取5个视野的平均值。
1.3.5 Masson染色：按照改良Masson三色染色试剂盒说明书进行染色，脱水后用二甲苯透明、封片，完成操作后将切片在Nikon倒置显微镜下拍照进行分析。观察各组SD大鼠瘢痕组织胶原纤维的分布与排列。应用Image-Pro Plus 6.0进行分析，测量积分吸光度值和图像面积，求每个视野积分吸光度与图像面积的比值，记为光密度值。
1.3.6 实时荧光定量RT-PCR检测：取SD大鼠瘢痕组织100 mg置于匀浆器中，加入裂解液进行匀浆，提取总RNA，并逆转录为cDNA，最后进行qPCR进行检测。所需引物由上海生工生物有限公司合成。见表1。以GAPDH基因作为内参，采用lg2-ΔCT法计算瘢痕组织中IL-6和TNF-α mRNA的表达，ΔCT=CT（目的基因）-CT（GAPDH）。
表1 各基因引物序列
1.3.7 统计学分析：采用Excel进行数据汇总。GraphPad Prism version 5.0软件进行制图。SPSS 22.0统计软件对数据进行统计学分析。采用Spapiro-Wilk进行正态性检验，Levene检验进行方差齐性检验。符合正态且方差齐的计量资料以均数±标准差（±s）表示，两独立样本进行t检验；
多组数据采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD法。不符合正态分布计量资料采用M（P25,P75）表示，两独立样本采用Mann-Whitney U检验；
多组数据采用Kruskal-Wallis单因子方差分析，两两比较采用Dunnett法。P＜0.05为差异有统计学意义（双尾）。
2.1 复方肝素钠尿囊素凝胶对创面愈合率的影响：烧伤后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d和42 d，对A1组和A2组创面进行拍照。见图2。3 d、7 d和14 d，A1组和A2组创面愈合率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。A1组在14 d应用复方肝素钠尿囊素凝胶后，21 d创面愈合率与A2组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；
28 d、35 d和42 d创面愈合率与A2组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。应用复方肝素钠尿囊素凝对创面愈合率有一定影响。见图3。
图2 A1组和A2组不同时间大鼠烧伤创面愈合情况
图3 A1组和A2组不同时间大鼠烧伤创面愈合率比较
2.2 不同时间应用复方肝素钠尿囊素凝胶对瘢痕组织厚度的影响：各组间大鼠创面临近的正常皮肤组织表皮层和真皮层厚度比较差异无统计学意义（P＞0.05）。瘢痕组织厚度变化值为未应用组和应用组与应用前对照组的差值，即未应用和应用复方肝素钠尿囊素凝胶28 d后瘢痕组织厚度的变化量。A2组和B2组瘢痕组织厚度的增长量较A1组和B1组低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。三个时间点未应用组和应用组瘢痕组织厚度的差值A组、B组均大于C组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。各组瘢痕组织HE染色结果见图5。
表2 未应用组与应用组瘢痕厚度变化比较 （±s,μm）
表2 未应用组与应用组瘢痕厚度变化比较 （±s,μm）
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图4 各组瘢痕组织厚度变化量比较
图5 各组瘢痕组织HE染色结果（100×）
2.3 不同时间应用复方肝素钠尿囊素凝胶对瘢痕组织胶原纤维的影响：改良Masson染色瘢痕组织后，胶原纤维呈蓝色，肌纤维、胞质、纤维素、角蛋白和红细胞呈红色，见图6。胶原纤维光密度变化值为未应用和应用复方肝素钠尿囊素凝胶28 d后瘢痕组织胶原纤维光密度值的变化量。A2组、B2组、C2组瘢痕组织胶原纤维光密度值的增长量分别较A1组、B1组、C1组低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。三个时间点未应用组和应用组胶原纤维光密度值变化量差值比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中，A组明显大于C组，差异有统计学意义（P＜0.05）；
A组与B组、B组与C组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图7。
图6 各组瘢痕组织Masson染色结果（100×）
图7 各组瘢痕组织胶原纤维光密度值变化量比较
表3 未应用组与应用组胶原纤维光密度值变化比较 [±s，M（P25,P75）]
表3 未应用组与应用组胶原纤维光密度值变化比较 [±s，M（P25,P75）]
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2.4 不同时间应用复方肝素钠尿囊素凝胶对瘢痕组织IL-6和TNF-α mRNA表达的影响：IL-6和TNF-α mRNA的相对表达变化值为未应用和应用复方肝素钠尿囊素凝胶28 d后瘢痕组织IL-6和TNF-α mRNA相对表达的变化量。A2组IL-6和TNF-α mRNA相对表达的变化量较A1组低，差异有统计学意义（P＜0.05）；
B2组IL-6 mRNA相对表达的变化量较B1组低，差异有统计学意义（P＜0.05）；
B2组与B1组TNF-α mRNA相对表达的变化量比较差异无统计学意义（P＞0.05）；
C2组与C1组IL-6和TNF-α mRNA相对表达的变化量比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表4。三个时间点未应用组和应用组IL-6 mRNA相对表达变化量的差值A组最大，B组次之，C组最小，差异有统计学意义（P＜0.05）；
三个时间点未应用组和应用组TNF-αmRNA相对表达变化量的差值比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图8。
表4 未应用组与应用组IL-6和TNF-α mRNA相对表达量变化比较 （±s）
表4 未应用组与应用组IL-6和TNF-α mRNA相对表达量变化比较 （±s）
图8 各组瘢痕组织IL-6和TNF-α mRNA相对表达变化量比较
2.5 各组炎性细胞、成纤维细胞和胶原纤维的分布与排列：A1组、B1组和C1组未应用复方肝素钠尿囊素凝胶，炎性细胞明显增多，成纤维细胞增生明显，胶原纤维排列紊乱，结构致密，增生明显。A2组、B2组和C2组应用复方肝素钠尿囊素凝胶，炎性细胞相对较少，成纤维细胞和胶原纤维增生相对较少，胶原纤维排布相对规则，结构疏松，间隙较宽。见图5～6。
烧伤是日常生活中常见的意外伤害之一，我国每年有超2 000万人因不同程度的烧伤入院，其中又以深Ⅱ度烧伤最为常见[7]。深Ⅱ度烧伤伤及真皮网层，因此极易发生异常增生，形成HS。复方肝素钠尿囊素凝胶内含洋葱提取液、肝素钠和尿囊素，具有抑制成纤维细胞的增殖、避免组织硬化、抗炎、增加瘢痕表面弹力、减少病理性胶原过度增生和促进细胞上皮化的作用，常于创面愈合后立即应用，临床治疗作用明确，但有研究发现部分患者治疗效果不甚理想[3-4]。瘢痕的增生过程可分为炎症期（肉芽组织期）、增生期、重塑期（瘢痕成熟期）3个阶段[5]。各个阶段细胞生长环境不同，药物作用效果也因应用时间不同可产生巨大的差异。在炎症阶段，炎症细胞可浸润到伤口位置，清除细菌和坏死组织，并分泌细胞因子激活成纤维细胞的增殖和血管发生；
在增殖阶段，创面完全愈合，成纤维细胞产生大量胶原纤维和及其他细胞质基质蛋白；
在成熟阶段，瘢痕组织重塑，最终成熟。有研究表明，深Ⅱ度烧伤大鼠创面成纤维细胞在第14天增殖最活跃[8]，在第28天创面基本愈合，开始进入增殖阶段[9]。这也是本次实验设定复方肝素钠尿囊素凝胶应用时间的依据。
复方肝素钠尿囊素凝胶作为一种抗HS的药物，具有抗纤维母细胞增生和抑制细胞外基质生成的作用[10]。因此，在临床中复方肝素钠尿囊素凝胶在创面愈合后立即使用。本研究发现，烧伤后第3、7和14天，A1组和A2组创面愈合率比较差异无统计学意义。A1组在14 d应用复方肝素钠尿囊素凝胶后，第21天创面愈合率与A2组比较差异有统计学意义,第28、35和42天创面愈合率与A2组比较差异无统计学意义。因此，应用复方肝素钠尿囊素凝胶对创面愈合有一定影响。
增生性瘢痕形成机制复杂，主要是由于皮肤过度修复，即真皮成纤维细胞为主的细胞大量增殖及以胶原纤维为主的细胞外基质过度堆积[11]。成纤维细胞和胶原纤维的排列结构和组成比例的改变可直接影响瘢痕组织的质地。在本研究中14 d和28 d应用复方肝素钠尿囊素凝胶后成纤维细胞和胶原纤维的表达减少，最终有效抑制瘢痕增生，且14 d应用复方肝素钠尿囊素凝胶后效果最明显。大鼠创面在第14天成纤维细胞增殖最活跃[8]。推测复方肝素钠尿囊素凝胶在成纤维细胞和胶原纤维活跃的初期作用更加明显。而42 d应用复方肝素钠尿囊素凝胶仅能抑制胶原纤维的表达，对瘢痕组织的厚度无明显的影响，这可能是增生后期细胞处于相对稳定状态，对药物反应不明显。
有研究表明，皮肤在损伤后为更好的进行修复，开始启动机体免疫系统，适度的炎症反应有利于溶解和去除组织碎片，抑制细菌，防止加重感染，而过度持续性的慢性炎症则会造成创面愈合障碍并刺激成纤维细胞增殖分裂[12]。皮肤损伤后，在急性炎症期积极治疗，可抑制IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23和TNF-α等炎症因子的过表达，进而抑制增生性瘢痕的产生和减少创面皮肤的色素沉积[13]。转化生长因子β1（TGF-β1）及其下游Smad家族的信号转导通路在增生性瘢痕发病机制中发挥关键作用。既往研究发现，IL-6 过表达可诱导Th1细胞反应，进而激活TGF-β1/Smad3信号通路，将急性炎症转变为慢性炎症，促进纤维化状态，从而导致瘢痕的增生[14-15]。本研究发现，14 d应用复方肝素钠尿囊素凝胶可显著降低IL-6和TNF-α mRNA的相对表达；
28 d仅能显著降低IL-6 mRNA的相对表达；
42 d不能显著降低IL-6和TNF-α mRNA的相对表达。提示在炎症期应用复方肝素钠尿囊素凝胶的抑炎作用更加明显，后期由于创面愈合，炎症因子表达相对降低，故复方肝素钠尿囊素凝胶抑制炎症作用降低。
本研究的目的是探讨复方肝素钠尿囊素凝胶抑制HS的最佳应用时间。在14 d应用复方肝素钠尿囊素凝胶后，与未应用组比，仅在21 d瘢痕愈合产生差异，之后无明显影响，这可能与复方肝素钠尿囊素凝胶影响肉芽组织的产生同时具有抗炎作用，两者作用效果叠加导致。王茶锋等[16]研究发现，对122例儿童颜面部软组织挫伤患者于术后早期应用复方肝素钠尿囊素凝胶预防瘢痕，并随访6个月～1年，均无明显瘢痕且外观及功能的恢复理效果想。本研究也有相似的结果，在14 d应用复方肝素钠尿囊素凝胶对抑制瘢痕增生和胶原纤维生成方面明显较28 d和42 d效果好。目前，复方肝素钠尿囊素凝胶应用于完全愈合后，这是为防止其抑制创面愈合而引起感染。然而，随着人们意识的提高、处理及时和抗生素的应用，烧伤创面感染的风险大大降低。提示，深Ⅱ度烧伤早期应用复方肝素钠尿囊素凝胶对抑制瘢痕增生效果会更加明显且不易发生感染。
综上所述，深Ⅱ度烧伤后14 d、28 d和42 d应用复方肝素钠尿囊素凝胶均可一定程度抑制大鼠瘢痕的增生，抑制胶原纤维和炎症因子基因的表达，其中14 d应用效果最佳。为临床更好的使用复方肝素钠尿囊素凝胶治疗HS提供了理论依据。
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