动物源性食品中喹诺酮药物的前处理提取优化研究
时间：2023-06-27 22:55:01 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
◎廖祺予
（四川省中安检测有限公司，四川 成都 610100）
兽药（Veterinary Drugs，VD）在兽医业中广泛应用于疾病治疗和预防，也可以用来提升养殖的效率。如果兽药使用不当，可能导致供人食用的动物源性食品中存在兽药残留，从而造成健康风险[1-2]。长期暴露在这种环境下，即使兽药残留的浓度很低，人群耐药性也可能会提高，造成不良的影响。喹诺酮类药物是一种抗微生物类的药物，典型代表有诺氟沙星、丹诺沙星、氧氟沙星[3]，随着各项技术的不断发展，各种新的喹诺酮药物的合成以及相应的检测方法相继问世。高效液相串联质谱法（LC-MS）以其液相强大的分离功能和质谱强大的检测功能等其他独特的优势，在检测分析领域深受喜爱并广泛应用，成为了国内外最常用的定量定性仪器[4]。
1.1 仪器设备
仪器型号厂家见表1。
表1 仪器型号厂家表
1.2 试剂
1.2.1 试剂信息
试剂纯度厂家见表2。
表2 试剂纯度厂家表
1.2.2 试剂的配置
（1）1%酸化乙腈：用10 mL 量筒量取0.01 L 甲酸，用玻璃棒转移至1 L 的容量瓶内，再用乙腈清洗量筒3 次，清洗液合并入量筒内，最后再用乙腈定容至刻度线，摇匀，有效使用期限30 d。
（2）20%甲醇水：用200 mL 量筒量取0.2 L 甲醇，用玻璃棒转移至1 L 的容量瓶内，再用超纯水清洗量筒3 次，清洗液合并入量筒内，最后再用超纯水定容至容量瓶的刻度线，摇匀，有效使用期限30 d。
（3）0.1%甲酸：用1 mL 移液枪移取0.001 L 甲酸，转移至1 L 的容量瓶内，最后再用乙腈定容至刻度线，摇匀，有效期30 d。
（4）10%酸化乙腈：用100 mL量筒量取0.1 L甲酸，用玻璃棒转移至1 L 的容量瓶内，再用乙腈清洗量筒3 次，清洗液合并入量筒内，最后再用乙腈定容至刻度线，摇匀，有效期30 d。
（5）5%酸化乙腈：用100 mL 量筒取0.05 L 甲酸，用玻璃棒转移到1 L 的容量瓶里，再用乙腈清洗量筒3 次，清洗液合并入量筒内，最后再用乙腈定容至刻度线，摇匀，有效期30 d。
2.1 提取
本方法适用于动物蛋类，鱼类，肌肉组织等动物源性食品中洛美沙星、恩诺沙星、单诺沙星等8 种喹诺酮类兽药残留量的测定。样品利用酸化乙腈提取试样中喹诺酮类化合物，利用净化剂去除试样中的油脂、水分、有机酸等，经LC-MS 测定，采用内标法定量[5]。
准确称取5 g 左右样品（精确到0.002 g）于50 mL 具塞离心管中，加入沙星类内标物标准工作液，加标样品进行加标。加入20 mL 1%的甲酸乙腈，均质1 min 再用涡旋仪进行混匀，超声提取30 min，4 000 r/min 离心5 min 再加入20 mL 1%甲酸乙腈第2 次重复提取，将2 次提取液合在一起，待净化。
2.2 净化
将合并后的提取液转移到125 mL 分液漏斗中，于分层后的上清液中加入25 mL 正己烷（乙腈饱和），振荡摇匀2 min，收集下层的乙腈溶液，舍弃上层的正己烷溶液，于40 ℃左右的旋蒸装置中浓缩至近干，最后用高纯度氮气吹干。
2.3 溶剂置换
加入1 mL 20%甲醇-水溶解，在涡旋仪上混匀30 s，定容液过0.22 μm 的绿色有机滤膜，除去颗粒物等杂质后供LC-MS 上机测定。
2.4 仪器参考条件
2.4.1 液相色谱参考条件
进样量为2μL，色谱柱为碳十八柱，色谱柱规格为1.8 μm 3.0 mm×50 mm，柱温箱的温度恒定为35 ℃，流速为0.3 mL/min，流动相为0.1%甲酸水和CH3OH，洗脱条件为梯度洗脱，详情见表3。
表3 液相洗脱条件表
2.4.2 质谱参考条件
离子源温度为350 ℃，MS 四级杆温度为100 ℃，扫描方式为正离子，采集类型为全扫描模式扫描，电离方式为大气压电喷雾离子源，简称ESI 源。质谱采集条件见表4。
表4 质谱采集条件表
2.5 提取液的选择
GB/T 20366-2006采用的提取液为2%的甲酸乙腈，但通过实验发现，提取效果不佳，不能使8 种沙星的回收率同时保证在一个优良的条件下。据了解，川内实验室多采用1%的甲酸乙腈进行提取，通过大量的实验数据证明甲酸浓度在1%时，回收率是最为优良的，最终确定8 种沙星的提取液为1%的加甲酸乙腈。
通过对动物蛋类、鱼类、肌肉组织3 种基质分别进行4 个梯度的实验（甲酸浓度0%、1%、5%、10%），每个梯度进行3 平行试验，RSD 在10%以内。得到加标回收率平均值，空白试验无值，样品本底无值，动物源性样品在质谱普遍存在电荷竞争现象，会造成回收率的影响，但已经在GB/T 21312-2007 和GB/T 20366-2006 所规定的范围（80%～120%），综上，考虑使用回收率较为优良的1%的甲酸乙腈。
2.6 净化方式的选择
GB/T 21312-2007 采用的是固相萃取，固相萃取（SPE）的工作有2 种方式，第1 种就是通过吸附提取目标物，第2 种则是通过吸附生物杂质，固相生物萃取方法是基于化学色谱方法原理而发展起来的一项技术，样品通过外界吹动装置的正压或者真空装置的负压或者两者的联合作用而通过SPE 小柱。由于不同固体上的吸附黏合剂可能会产生具有不同的有机官能基团，可以将特定的有机化合物固体吸附并将其保留在SPE 的圆柱上但该方法耗时长，操作烦琐，且动物源性食品中的油脂等基质会堵塞SPE小柱，导致淋洗洗脱的困难，更为严重者则根本无法进行淋洗洗脱[5]。
QuEChERS（Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe），是一种近几年新发展起来比较热门的一种净化基质的构象与操作。但该方法中所使用的C18 虽然对动物源性食品中的油脂有很好的除杂功能，但同时通过大量实验发现C18 会对目标物也造成影响，从而造成回收率的下降，达不到标准。
综上，选择了GB/T 20366-2006 中用正己烷来去除油脂等会造成基质抑制的杂质的方法，正己烷与油脂的极性相似，根据相似相溶原理，油脂会溶解在正己烷中，同时由于正己烷与乙腈的极性相差较大，不会相容，正己烷密度比乙腈小，所以说分层后正己烷层会在上层，乙腈层会在下层，这种方法既方便快捷，而且净化的效果也好，回收率也保持在了一个优良的水平。
3.1 线性范围，相关系数，检出限
根据线性范围、检出限分别配制浓度为0.5、1、2、4、8、16 μg/L 的6 个级别的标液。以仪器响应值为竖轴，浓度（μg/L）为横轴。根据规定以10 倍信噪比（S/N=10）为检出限，喹诺酮药物的检出限为0.5 ng/kg。对 比GB/T 21312-2007，1 ng/kg 的检出限，该方法的检出限更低，检测更灵敏，满足国家检测要求。
3.2 精密度和回收率的检测
回收率和精密度实验以加标回收率为验证标准，在食品中选取不含喹诺酮药物的动物肌肉组织、鱼肉、蛋类基质进行加标回收率验证。根据国家标准GB/T 27404-2008中的相关规定选取1倍定量限1.5 μg/L、2 倍定量限3 μg/L、10 倍定量限15 μg/L 为该方法验证的3 个加标水平用对样品进行加标。进行3 个水平，每个水平六平行的回收率验证实验，按照前面所述的前处理方法进行实验。实验结果表明在不同的基质影响下加标回收和RSD 都保持在了一个良好的水平，且完全符合GB/T 27404-2008。
3.3 准确度实验
用本方法测定有真值的质控样品。平行测定 6次。测定值与真值见表5。各项测定结果都满足GB/T 27404-2008 中各项相关规定，能够很好地对待测样品中的喹诺酮类药物进行准确定量分析。
表5 测定值与真值表
该方法改进了提取液中甲酸的浓度，通过对比各种酸度下乙腈的提取效果来选择最优方案，提取效果用回收率表示，回收率为不同浓度下液相质谱串联仪上的检测结果浓度和加入浓度计算所得，根据结果显示改进后的方法对于动物肌肉组织、鱼类、蛋类有良好的检测效果。在保持较好的灵敏度，准确度和精确度下，仍然能够保持较好的回收率。并且前处理的方法比其他方法简单快捷，适用的基质种类范围也比较广，在面对大批量的样品时，能够很好地节省人力和物力，提高检测的效率。
猜你喜欢量筒喹诺酮正己烷正己烷在不同硅铝比HZSM-5分子筛上吸附的分子模拟研究石油炼制与化工(2022年2期)2022-02-15细化量筒 细说作用中学生数理化·八年级物理人教版(2022年12期)2022-02-14关注氟喹诺酮类药品的严重不良反应世界最新医学信息文摘(2021年12期)2021-06-09溶剂解析气相色谱法对工作场所空气中正己烷含量的测定化工管理(2020年26期)2020-10-09蒸腾作用阅读（科学探秘）(2020年2期)2020-04-02正己烷-乙酸乙酯共沸物萃取精馏工艺模拟研究山东化工(2019年2期)2019-02-21基于传感器的正己烷检测与风险评估系统的设计电子技术与软件工程(2016年24期)2017-02-23无氟喹诺酮类抗菌药研究进展国外医药（抗生素分册）(2016年5期)2016-07-12无氟喹诺酮:奈诺沙星国外医药（抗生素分册）(2016年2期)2016-07-12氟喹诺酮类药物临床常见不良反应观察中国卫生标准管理(2015年25期)2016-01-14
