基于高效液相指纹图谱及网络药理学预测分析山银花质量标志物
时间：2023-06-26 17:10:04 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
周新茹，王志辉,2，龙雨青，曾 梅，杨 敏，童巧珍,2 ,3，周日宝,2,3*，刘湘丹,2,3*
1湖南中医药大学药学院；
2 湘产大宗道地药材种质资源及规范化种植重点研究室；
3湖南省普通高等学校中药现代化研究重点实验室，长沙 410208
山银花甘，寒，归肺、心、胃经，具清热解毒，疏散风热功效，用于痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热等症[1]，目前《中国药典》有山银花的中成药处方达80多个，如感冒止咳片、口炎清片、感冒止咳胶囊、清肝利胆颗粒、银屑灵颗粒等。山银花不仅为大宗常用中药材、成方制剂原材料，也是化工香料提取原料，同时还作为茶叶和护肤保健品开发，市场应用前景广阔。
现代研究表明，山银花化学成分数量多且复杂，包括有机酸类、三萜皂苷类、黄酮类、挥发油类及微量元素等[2]。目前《中国药典》仅将绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙及川续断皂苷乙作为山银花质量评价指标，只对有机酸类与皂苷类共3种化学成分做了限量规定。大量研究表明木犀草苷等黄酮类成分也是山银花发挥药效的物质基础，中药化学成分复杂，发挥药效并不仅依靠某一化学成分，而是多个组分内部之间存在普遍的加合作用，因此仅以少数成分对药材进行品质评价不够全面。
为提升规范中药材及产品质量标准，刘昌孝院士[3-7]在研究分析现有质量评价控制方法问题的基础上，于2016年提出了中药质量标志物(Q-Marker)的概念。中药质量标志物有传递与溯源、特有性、有效性、可测性及复方配伍五原则[8-10]，可作为较全面的中药材及产品质量评价控制指标。Q-Marker这一概念提出后，被广泛应用于解析中药材、饮片、制剂与有效性密切相关的中药内在化学质量属性，为中药材及其产品的全过程质量控制及质量溯源提供了新的思路。
隆回、溆浦为湖南灰毡毛忍冬来源山银花主产区，根据其花冠后期是否展开分五彩花(花冠展开)和湘蕾(花冠不展开)两大类，目前产地初加工方式主要有蒸汽杀青与低温干燥两种，从而市场形成了四种湘产山银花药材规格：蒸汽杀青湘蕾、低温干燥湘蕾、蒸汽杀青五彩花、低温干燥五彩花。为评价不同规格湘产山银花质量，建立比较全面的质量评价指标，本文基于中药质量标志物的概念，结合HPLC指纹图谱、多元统计分析和网络药理学等研究方法预测并验证山银花Q-Marker，以期为山银花质量评价和质量控制提供思路和参考。
1.1 仪器
Agilent 1260型高效液相色谱仪(包括G1312C二元泵、G1316A柱温箱、G7129A自动进样器、VVID检测器，美国Agilent公司)；
色谱柱：Agilent ZORABAX SB-C18(250 mm×4.6 mm)；
SK8200型超声仪(上海科导超声仪器有限公司)；
Eco-S15型实验室纯水系统(上海和泰仪器有限公司)。
1.2 试药
新绿原酸(20 mg/支，批号：19081403)；
绿原酸(20 mg/支，批号：18071907)；
咖啡酸(20 mg/支，批号：20110501)；
獐芽菜苷(20 mg/支，批号：19090902)；
3，4-二-O-咖啡酰奎宁酸(异绿原酸B，20 mg/支，批号：21022308)；
3，5-二-O-咖啡酰奎宁酸(异绿原酸A，20 mg/支，批号：21032304)；
灰毡毛忍冬皂苷乙(20 mg/支，批号：20072203)；
川续断皂苷(20 mg/支，批号：19120601)对照品均购自成都普菲德生物科技有限公司，质量分数均≥98%；
甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯；
水为超纯水；
其余试剂均为分析纯。29批山银花样品采自湖南隆回和溆浦，具体信息见表1，经湖南中医药大学周日宝教授与刘湘丹副教授鉴定为忍冬科植物灰毡毛忍冬L.macranthoidesHand.-Mazz.的干燥花蕾及带初开的花。
表1 山银花样品来源信息表Table 1 Information of the source of Lonicerae Flos samples
续表1(Continued Tab.1)
1.3 数据库与软件
中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012 年版)；
Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；
Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)；
STRING(https：//string-db.org/)数据库；
Cytoscape 3.8.2软件；
Metascape(www.metascape.org/)数据库；
PDB数据库(https://www.rcsb.org/)；
ZINC数据库(http://zinc.docking.org)；
Schrödinger软件。
2.1 山银花指纹图谱研究
2.1.1 色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶(非亲水性)为填充剂(4.6 mm×250 mm，5 μm)；
以乙腈为流动相A，以0.4%磷酸水溶液为流动相B，按下表2进行梯度洗脱；
柱温30 ℃；
检测波长：210 nm。
表2 梯度洗脱条件Table 2 Gradient elution conditions
2.1.2 对照品溶液制备
精密称取新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、灰毡毛忍冬皂苷甲、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙对照品适量，用70%甲醇溶解分别制得对照品溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，密封，低温避光保存，备用。
2.1.3 供试品溶液制备
精密称取供试山银花样品粉末1 g，置于带塞锥形瓶中，加入70%甲醇溶液50 mL，称重，静置12 h后，室温超声30 min后用70%甲醇补重，取上清液过0.45 μm微孔滤膜，制得供试品溶液。
2.1.4 方法学考察
2.1.4.1 精密度试验
取S20号样品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下连续进样6次，记录色谱图。以异绿原酸A为参照峰，测得22个共有峰相对保留时间的RSD在0.003%～2.07%，相对峰面积的RSD在1.00%～2.99%，表明仪器精密度良好。
2.1.4.2 重复性试验
取S20号样品6份，每份精密称取1 g，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样，记录色谱图。以异绿原酸A为参照峰，测得22个共有峰相对保留时间的RSD在0.01%～2.78%，相对峰面积的RSD在0.52%～2.67%，表明该方法重复性良好。
2.1.4.3 稳定性试验
精密称取S20号样品1 g，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下，分别于0、4、8、12、18、24 h进样，进行色谱分析，记录色谱图。以异绿原酸A为参照峰，测得22个共有峰相对保留时间的RSD在0.30%～2.57%，相对峰面积的RSD在0.31%～3.00%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.1.5 指纹图谱的建立
将29批山银花药材样品供试品溶液分别进样测定，将图谱以AIA格式保存，导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012 年版)。以S1号图谱作为参照谱，采用中位数法，进行多点校正和色谱峰匹配，29批山银花药材样品共得到了22个共有峰，其指纹图谱叠加图见图1，对照指纹图谱见图2，混合对照品图谱见图3。
图1 29批山银花样品指纹图谱叠加图Fig.1 Fingerprint superposition of 29 batches of Lonicerae Flos
图2 29批山银花对照指纹图谱Fig.2 Reference fingerprint of Lonicerae Flos
图3 混合对照品图谱Fig.3 HPLC of mixed reference substances注：1-新绿原酸；
2-绿原酸；
3-咖啡酸；
4-獐牙菜苷；
5-木犀草苷；
6-异绿原酸B；
7-异绿原酸A；
8-灰毡毛忍冬皂苷乙；
9-灰毡毛忍冬皂苷甲；
10-川续断皂苷乙。Note:1-Neochlorogenic acid;2-Chlorogenic acid;3-Caffeic acid;4-Sweroside;5-Cynaroside;6-Isochlorogenic acid B;>7-Isochlorogenic acid A;8-Macranthoidin B;9-Macranthoidin A;10-Dipsacoside B.
2.1.6 相似度分析
将 29批山银花的图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012 年版)，计算相似度，结果29批山银花的相似度见表3。29批山银花的指纹图谱相似度均>0.95，表明所采集的山银花样品质量稳定均一。
表3 山银花药材相似度结果Table 3 Results of similarity evaluation of 29 batches of Lonicerae Flos
2.1.7 层次聚类分析
运用SPSS 26数据统计软件，采用组间聚类方法，欧氏距离平方法测量样品间距离进行系统聚类分析(hierarchical clustering analysis，HCA)，结果见图4。由图可知，在分类距离为20时，山银花样本被分为两大类，S1、S4、S5、S15、S16、S22、S23、S26、S27、S29 、S6、S7、S17、S18为一类，S3、S8、S13、S14、S19、S24、S28、S2、S9、S10、S11、S12、S20、S21、S25为一类。在距离为6时，样本被分为4类，山银花各批次间有明显的分类距离；
S1、S4、S5、S15、S16、S22、S23、S26、S27、S29被归为一类，S6、S7、S17、S18被分为一类，S3、S8、S13、S14、S19、S24、S28 被分为一类，S2、S9、S10、S11、S12、S20、S21、S25被归为一类。
图4 聚类分析结果Fig.4 Systematic tree map
2.1.8 正交偏最小二乘法判别分析
图5 山银花成分VIP图Fig.5 OPLS-DA score scatter plot of 29 batches of Lonicerae Flos
2.2 基于成分-靶点-通路的有效性分析
对本研究图5中VIP>1且通过对照品指认的八种化学成分(绿原酸、异绿原酸A、新绿原酸、獐芽菜苷、异绿原酸B、灰毡毛忍冬皂苷乙、咖啡酸、川续断皂苷乙)进行网络药理学研究，验证分析山银花的潜在质量标志物的有效性，相关活性化合物信息如表4所示。
表4 活性化合物信息表Table 4 Information of active compound
2.2.1 靶标的预测筛选与蛋白质互作网络构建及分析
使用 Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)数据库对以上8个活性化合物进行靶标预测，选择其中可能性(Probability)大于0的靶点合并、删除重复项，共获得154个人源靶标。将潜在靶标导入STRING(https：//string-db.org/)数据库，选择物种为人类，设置combined_score≥0.9的97个靶标作为相互作用关系数据 ，通过Cytoscape 3.8.2软件绘制PPI网络，并使用Cytoscape 3.8.2软件中的Network Analyze工具进行网络拓扑学分析，计算度值(degree)、介数中心性(betweenness centrality)和接近中心性(closeness centrality)等参数，见图6。该网络由97个节点(靶标)组成，以尺寸和颜色来表示拓扑学参数值大小，颜色越深尺寸越大表示拓扑学参数越大。选取度值≥6(二倍中位数)、介数中心性和接近中心性2 个重要拓扑参数均大于中位数的靶点作为核心靶点[11]，如图6所示，核心靶标共有16个：STAT3、EGFR、MAPK1、APP、PIK3CA、ITGB1、CASP3、FYN、ESR1、LCK、CASP8、PRKCD、MAP2K1、ERBB2、SYK、JUN。
图6 蛋白质互作图Fig.6 Protein-protein interaction network
2.2.2 基因功能富集分析
通过 Metascape(www.metascape.org/)在线基因功能富集分析工具对16个核心靶标进行基因本体论(gene ontology，GO)和全基因组及代谢途径(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析，设定分析的物种为“智人”，其他选项设定默认，选择P值≤0.01进行个性化分析。根据数据信息，选择按照P值升序排列的前15条基因功能，以名称与富集因子使用微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)网站可视化作图得到分子生物学功能(molecular function，MF)、生物学过程(biological process，BP)和细胞学组分(cellular components，CC)的柱状图，选择按照P值升序排列前15条的基因通路制作KEGG通路气泡图。
2.2.2.1 靶标的GO功能注释
GO功能注释结果见图7，包括16个核心靶标的BP(332条)、CC(29条)和MF(35条)的富集结果。柱状图纵坐标为count，以不同的颜色区分GO注释的三大功能。因条目数量过多，每个功能注释仅展示p值最小前15的条目，见图7。主要涉及水解酶活性正向调节、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、酶联受体蛋白信号通路、细胞的激活、造血或淋巴器官的发育、免疫系统生长、蛋白质磷酸化、peptidyl-tyrosine磷酸化、peptidyl-tyrosine改变、对生长因子的响应、对无机物的反应、白细胞激活、细胞对有机氮化合物的反应、细胞对氮化合物的反应、蛋白质磷酸化的正向调节、膜筏、microdomain、细胞质的核周区、神经胶质细胞投影、质膜蛋白复合物、早期内体、复杂受体、质膜细胞质侧的外源性成分、膜的外部成分、囊腔、细胞前缘、粘着斑、细胞基质结、质膜外源成分、质膜的细胞质侧、蛋白质酪氨酸激酶活性、蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、醇基受体磷酸转移酶活性、激酶活性、酶激活活动、磷酸酶绑定、非跨膜蛋白酪氨酸激酶活性、磷脂酶激活活动、链接蛋白结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、激酶绑定、脂肪酶催化剂活性、磷脂酶结合、蛋白磷酸酶绑定等生物活动。
图7 GO功能注释柱状图Fig.7 The bar graph of GO function enrichment analysis
2.2.2.2 靶标信号通路富集分析
对山银花的16个核心靶标的通路富集分析如图8(仅展示p值最小的15条)所示，图中点的大小代表count，颜色深浅代表-log10(P)，横坐标代表GeneRatio，结果表明主要涉及癌症通路、癌症蛋白聚糖通路、PD-L1在癌症中的表达和PD-1检查点通路、卡波济肉瘤相关疱疹病毒感染、内分泌的阻力、粘着斑、破骨细胞分化、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、雌激素信号通路、乳腺癌、丙型肝炎、非小细胞肺癌、乙型肝炎、胰腺癌、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药等115条信号通路。
图8 靶标信号通路富集分析气泡图Fig.8 The bubble chart of KEGG function enrichment analysis
2.2.3 化合物-靶标-通路网络构建与分析
将上述分析得到115个通路及16个关键靶标与对应的化合物数据导入Cytoscape 3.8.2软件构建“化合物-靶标-通路”网络，如图9所示[12]。图中外面两层蓝色圆点为115个通路，最内层红色圆点为8个潜在质量标志物，次内层绿色远点为16个核心靶点。
图9 化合物-靶标-通路网络图Fig.9 Compound-target-pathway network diagram
2.2.4 分子对接验证
根据上述网络药理学结果结合考量山银花功效，选择STAT3、EGFR、MAPK1及PIK3CA作为分子对接验证的靶标蛋白，从PDB数据库中下载STAT3(ID:5AX3 配体：5ID)、EGFR(ID:6JRK 配体：C6O)、MAPK1(ID:TAUV 配体：RYW)及PIK3CA(ID:3ZIM 配体：KKR)结构，从ZINC数据库下载8个潜在质量标志物化合物的mol2格式，使用Schrödinger软件中的Protein Preparation wizard模块对蛋白质进行补足缺失残基以及中性化等操作，最后进行能量最小化并添加OPLS4力场，使用Receptor Grid Generation模块根据原有配体默认生成Grid文件，采用Schrödinger的LigPrep模块对各分子进行加氢、能量最小化、几何优化等处理，在OPLS4的力场下，将蛋白质与化合物对接，并将打分结果与原配体化合物进行对比[13]，对接结果见表5，对接结合见图10。8个化合物与蛋白质对接后docking score均<0，93.75%的化合物docking score<-5且与原活性化合物对接结果相近，证明8个成分与靶点对接效果良好。
表5 成分与关键靶蛋白的分子对接结果Table 5 Binding result of components with its key targets
图10 EGFR蛋白与獐芽菜苷(A)、灰毡毛忍冬皂苷乙(B)对接图Fig.10 Docking diagram of EGFR protein with sweroside (a) and macranthoidin B (b)
2.3 化学可测性分析
2.3.1 方法学考察
2.3.1.1 标准曲线的绘制
取对照品溶液，70%甲醇等比稀释新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、獐芽菜苷、异绿原酸B、异绿原酸A、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，密封，低温避光保存，备用。精密吸取各浓度对照溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，按“2.1.1”项色谱条件测定，以对照品浓度(mg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，8种化学成分线性回归方程见表6。
表6 山银花中8种化学成分线性回归方程Table 6 Linear regression equations of eight chemical constituents of Lonicerae Flos
从表6可知，新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、异绿原酸B、异绿原酸A、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙线性关系良好。
2.3.1.2 精密度实验
取S20号样品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在该项色谱条件下连续进样6次，记录色谱图。测得新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、异绿原酸B、异绿原酸A、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙峰面积的RSD分别为2.42%、0.32%、0.99%、1.18%、2.34%、0.24%、1.45%、0.93%，表明仪器精密度良好。
2.3.1.3 稳定性实验
精密称取S20号样品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在该项色谱条件下，分别于0、4、8、12、18、24 h进样，进行色谱分析，记录色谱图。测得新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、异绿原酸B、异绿原酸A、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙峰面积的RSD分别为2.99%、0.44%、2.20%、2.47%、2.65%、0.37%、1.83%、0.92%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.3.1.4 重复性实验
精密称取S20号样品6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在该项色谱条件下进样，记录色谱图。测得新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、异绿原酸B、异绿原酸A、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙峰面积的RSD分别为1.98%、1.86%、1.56%、2.26%、2.52%、1.47%、2.29%、1.22%，表明该方法重复性良好。
2.3.1.5 加样回收实验
精密称定已知含量的对应山银花样品6份，分别精密加入适量对照品溶液，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按照2.1.1项色谱条件下进样，记录色谱图，计算加样回收率。结果表明新绿原酸的平均回收率为102.84%(RSD=2.28%)，绿原酸的平均回收率为96.44%(RSD=0.74%)，咖啡酸的平均回收率为100.68%(RSD=2.53%)，獐牙菜苷的平均回收率为100.28%(RSD=1.32%)，异绿原酸B的平均回收率为101.97%(RSD=0.80%)，异绿原酸A的平均回收率为99.79%(RSD=2.70%)，灰毡毛忍冬皂苷乙的平均回收率为99.71%(RSD=1.14%)，川续断皂苷乙的平均回收率为100.38%(RSD=2.30%)，表明该方法的回收率良好。
2.3.2 含量测定
按“2.1.3”项下方法制备29批山银花样品供试品溶液，按“2.1.1”项色谱条件进样，记录色谱图，根据表6中标准曲线进行计算，其百分含量结果见表7。
表7 山银花样品中8种化学成分的含量Table 7 Content of eight main components of Lonicerae Flos
2.4 基于植物亲缘性的质量标志物分析
2005版《中国药典》始将金银花和山银花分列，其中忍冬科忍冬干燥花蕾或带初开的花临床作金银花入药；
灰毡毛忍冬、红腺忍冬、华南忍冬及黄褐毛忍冬干燥花蕾或带初开的花临床作山银花使用，建立同科同属不同种来源中药材(金银花和山银花)的定性鉴别方法以确保入药来源的准确性十分必要。Wang等[14]采用 UPLC 法测定新绿原酸、绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙等含量，用于定性鉴别区分金银花和山银花；
金银花与山银花上述成分含量不同，金银花皂苷类成分极低不易检测，而山银花中皂苷类含量高；
Zhang等[15]利用测定金银花与灰毡毛忍冬中的新绿原酸、绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A等成分的含量区分忍冬与灰毡毛忍冬。综上所述，金银花与山银花在酚酸类、黄酮类及皂苷类成分含量上存在显著差异，将新绿原酸、绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙等作为山银花的质量标志物能够区别不同来源“银花”。
3.1 基于化学成分可测性对质量标志物讨论
本文通过HPLC建立了山银花的指纹图谱，29批山银花样品间相似度>0.95，方法学考察结果证明HPLC指纹图谱稳定可靠。对山银花进行潜在质量标志物的含量测定，结果表明，所有样品以上8种成分均可检测，且所有样品绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙及川续断皂苷乙成分含量都远高于药典标准，表明湖南产不同规格山银花质量均良好。HCA分析结果表明，在分类距离为20时，除18号样品外，其他样品按加工方式聚成两大类(蒸汽杀青、低温干燥)；
在分类距离为6时，除1、27、13、18外其他样品按照品种与加工方式的不同聚成4类(蒸汽杀青湘蕾、蒸汽杀青五彩花、低温干燥湘蕾、低温干燥五彩花)。其中，1、27是蒸汽杀青湘蕾但与低温干燥湘蕾在HCA分析中分类距离更近，18是蒸汽杀青的五彩花在分类学上与低温干燥五彩花分类更近，13是蒸汽杀青湘蕾与蒸汽杀青五彩花分类更近，提示加工方法对药材品质有较大的影响。
3.2 基于有效性对质量标志物讨论
山银花入药时其味甘，寒，归肺、心、胃经，具清热解毒，疏散风热功效。现代研究表明，甘味[16]与皂苷、维生素、蛋白质、甾醇及氨基酸等成分有关，清热解毒、疏散风热与现代研究中的抗炎抗菌增强免疫等反应有关。运用网络药理学从有效性角度分析发现，咖啡酸、獐牙菜苷等八种化合物通过调控STAT3、EGFR、MAPK1、APP、PIK3CA、ITGB1、CASP3等16个关键靶点，作用于能量代谢、神经递质传递、炎症反应等生理过程，与其清热解毒、疏散风热的传统功效相关。
深入分析相关靶点可以发现，炎症反应的靶点尤其多，以STAT3与EGFR靶点为例 。STAT3靶点全称Signal Transducer And Activator Of Transcription 3，信号转换器与转录激活器[18]。STAT家族成员作为细胞因子和生长因子[18]，该蛋白可被各种细胞因子和生长因子磷酸化激活，包括EGF、IL5、IL6、HGF、LIF和BMP2[18]。EGFR靶点全称表皮生长因子受体，该蛋白是表皮生长因子家族成员的受体[17]。EGFR诱导受体二聚化和酪氨酸自磷酸化，导致细胞增殖[18]。EGFR是导致新冠病毒(COVID-19)由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)感染引起的严重形式的细胞因子风暴的组成部分[18,19]。研究证实，上述靶点确为肺部相关感染中表现突出的靶点，与山银花的传统性味归经一致。
文献表明咖啡酸通过NF-kB依赖性途径抑制TNF-α和PGE2的产生，提高巨噬细胞的细菌清除活性[20]，抑制AGE的形成，调节肠道炎症[21]，降低血清和肾脏中ACE和精氨酸酶活性、降低MDA和升高NOx水平来抗高血压[21]，阻断STAT3和抑制MMP2和MMP-9，阻止ROS的产生以及减少肿瘤细胞血管生成来起抗肝癌作用[22]，激活JNK/Bcl-2介导的体外自噬降低A53Tα-突触核蛋白改善帕金森病行为并保护多巴胺能神经元[23]，降低氧化应激改善血脂水平，减少主动脉损伤抗动脉粥样硬化[24]。獐芽菜苷能通过上调miR-29a、抑制col1和TIMP1发挥抗肝纤维化作用[25]，抑制NLRP3炎症体的激活预防非酒精性脂肪性肝炎[26,27]，诱导肝癌细胞Akt磷酸化并抑制Pck1表达来抗癌[28]。通过代谢组学分析，异绿原酸A、异绿原酸B、绿原酸、新绿原酸、川续断皂苷乙等均为山银花的入血成分[29]，因此文献研究结果与网络药理学研究证明以上8个潜在质量标志物确为山银花发挥药效的物质基础。
综上，本研究基于HPLC指纹图谱结合聚类分析可有效区分不同品种与加工方式的山银花；
本研究基于OPLS-DA分析结果，结合网络药理学阐明了绿原酸、异绿原酸A、新绿原酸、獐芽菜苷、异绿原酸B、灰毡毛忍冬皂苷乙、咖啡酸、川续断皂苷乙8个化合物可作为山银花质量标志物，其为进一步建立提升山银花质量标准提供了参考。
