菌草酒酿造工艺优化及其品质分析
时间：2023-06-25 12:15:05 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
范锦琳, 张丽丽, 张煜隆, 林 辉, 易 超, 林占熺, 林冬梅
(1.福建农林大学生命科学学院；
2.国家菌草工程技术研究中心，福建 福州 350002)
菌草(JUNCAO)是1986年福建农林大学林占熺研究员提出的.菌草是草品种的一个新类别，是新的农业资源，是“菌”与“草”交叉科学研究与产业发展的一个新领域[1].菌草主要包括巨菌草、柠檬香茅、象草、五节芒、紫花苜蓿等草本植物.
酿酒的原料是保证成品酒品质的关键因素，对发酵后的感官特性有直接影响[2].生活中酿酒的原材料主要包括大米[3-4]、高粱[5-7]等谷物类，还有葡萄[8]、苹果[9]、百香果[10]等果蔬类，而这些原材料成本远高于巨菌草.巨菌草(CenchrusfungigraminusZ. X. Lin & D. M. Lin & S. R. Lan sp. nov.)属禾本科草本植物，是菌草中最重要的代表[11].巨菌草植株节节丛生，高大挺拔，在温度适宜的地区为多年生植物，具有产量高、纤维含量高、粗蛋白和糖分含量高的特点[12].师静等[13]对巨菌草纤维素的酶解条件进行研究，发现巨菌草中含有丰富的还原糖，这为利用巨菌草制备乙醇提供了理论依据.柠檬香茅(CymbopogoncitratusStapf)属禾本科草本植物，为常见的香草，具有柠檬香气，也被称为柠檬草，含有丰富的多糖、多酚、黄酮类及香茅精油[14]，这些成分具有降脂、降糖、抑菌等功效[15].童金华[16]以巨菌草、柠檬香茅和紫花苜蓿等为主要原料，研制出风味独特的菌草复合饮料.
目前，以巨菌草为主要原料酿造酒的相关研究尚未见报道.本研究以感官评分为综合评价指标，采用单因素试验结合响应面法对菌草酒的酿造工艺进行优化，得到发酵的最优工艺参数[17]；
通过对成品菌草酒的微生物安全性，理化、卫生指标，以及黄曲霉毒素含量进行分析，得到一种新型的符合国家标准的发酵酒，为开发菌草产业新产品提供了一条新途径，为菌草酒的工业化生产提供参考.
1.1 材料
巨菌草、柠檬香茅由福建农林大学旗山校区国家菌草工程技术研究中心基地提供.酒曲包含黄酒生料酿酒曲(龙岩)、安琪白酒曲、安琪甜酒曲(甜味型)、安琪甜酒曲(风味型)和白曲(龙岩)，均为市售，用密封袋密封并存放于4 ℃冰箱.
1.2 菌草酒的加工工艺流程
1.3 菌草酒酿造的工艺操作要点
1.3.1 筛选原料 挑选新鲜、无病虫害的菌草，用流水冲洗附着在菌草表面的污垢和杂质，置阴凉处将表面水分沥干.
1.3.2 调糖 添加一定量的白砂糖到菌草汁中，再将菌草汁的可溶性固形物含量调至一定水平，推算出菌草生料发酵所需要添加白砂糖的含量.
1.3.3 酿酒酵母的活化 配制成糖含量5%、温度35～40 ℃的无菌水溶液(酵母与水的体积比为1∶10)，小心混匀，静置后使其复水、活化；
隔10 min轻搅拌一下，使酵母通氧，15～25 min后有细腻泡沫出现即活化成功，再进行接种.
1.3.4 主发酵 在发酵前期进行厌氧发酵，在发酵后期定期进行排气.发酵启动后定期进行理化检测，以便对发酵过程进行监控.
1.3.5 后发酵 取发酵上清液在4 ℃条件下陈酿30 d.
1.4 菌草酒品质指标的测定
1.4.1 理化指标测定 残糖：将蒸馏水调零，采用数显糖度计测定果酒的糖度[18].
酒精度：参考国家标准[19]测定.
总酸：通过标定的氢氧化钠溶液的酸碱中和滴定来测定[20].
可溶性固形物：采用手持屈折计对酒液中可溶性固形物进行3次重复测定.
pH值：采用pH计测定[21].
1.4.2 菌草酒的安全性检测 微生物安全性指标检测参照国家标准[22].
理化和卫生指标的检测参照国家标准[23].
黄曲霉毒素的检测参照国家标准[24]，即使用酶联免疫吸附法(试剂盒)对菌草酒样品中的黄曲霉毒素B1(AFTB1)、黄曲霉毒素B2(AFTB2)、黄曲霉毒素G1(AFTG1)和黄曲霉毒素G2(AFTG2)进行检测.将AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG2按12∶6∶2∶1(体积比)混合，以混合毒素作为参照，对菌草酒样品中的黄曲霉毒素进行检测.
1.5 单因素试验
设置酿酒酵母种类、初始糖度、发酵温度、酒曲接种量和发酵时间5个因素进行单因素试验.
1.6 响应面优化试验
表1 响应面试验设计Table 1 Experimental design of response surface analysis
利用响应面优化法进一步对菌草酒的酿造工艺进行优化.响应面试验因素与水平见表1.根据单因素试验结果，采用Box-Behnken的中心组合设计原理，进行三因素三水平响应面优化试验，以感官评分为响应值，对菌草主发酵的发酵工艺条件进行优化[25].用Design Expert 8.0.6软件对响应面试验结果进行处理和方差分析，得到菌草酒最佳感官评分的二次多元回归方程.
1.7 感官评价
请10位食品专业感官品评员，参照感官评价标准(表2)对菌草酒进行感官评价；
采用百分制，取10位品评员的平均分值，确定一个最佳口感，从而得到一个最佳的优化工艺方案[26].
表2 感官评价标准表Table 2 Standards for sensory evaluation
1.8 数据分析
采用SPSS (16.0)对所得到的试验数据进行相关性及显著性分析，采用Design Expert 8.0.6进行绘图、分析.指标数值为3个重复的均值±标准差[27-29].
2.1 单因素试验
2.1.1 酿酒酵母对菌草酒品质的影响 在发酵温度25 ℃、初始糖度24°Brix、酒曲接种量0.3 g·L-1、发酵天数30 d的条件下，5种酵母菌对菌草酒品质的影响如表3所示.从表3可知：以安琪白酒曲为酿酒酵母获得的菌草酒的残糖含量最低；
以安琪甜酒曲(甜味型)和安琪甜酒曲(风味型)为酿酒酵母获得的菌草酒的残糖含量和pH值均较高，其中以风味型酒曲为酿酒酵母获得的菌草酒的残糖含量最高；
而采用白酒曲作为酿酒酵母酿造的菌草酒的可溶性固形物含量最高，达到20.6%；
采用风味型酒曲酿造的菌草酒的可溶性固形物含量最低，只有7.7%.从感官评价来看：利用安琪甜酒曲(甜味型)和安琪甜酒曲(风味型)为酿酒酵母获得的菌草酒的酒体口味不纯，有杂味；
以生料酿酒曲酿造的酒体微红，不够清透；
以白曲酿造的菌草酒的酒体比用安琪白酒曲酿造的稍显单调.孔明明[30]研究表明，酒中残糖含量和pH 值偏高不利于酵母菌的发酵，酸度高使得口感不佳.综上所述，利用安琪白酒曲作为酿酒酵母得到的菌草酒综合效果最好，因此选择安琪白酒曲作为菌草酒的最佳酿酒酵母.
表3 酿酒酵母对菌草酒品质的影响Table 3 Effect of yeast variety on quality of JUNCAO wine
2.1.2 初始糖度对菌草酒品质的影响 以安琪白酒曲作为菌草酒发酵酒曲，在发酵温度25 ℃、接种量0.3 g·L-1、发酵天数30 d的条件下，初始糖度对菌草酒口感的影响如表4所示.从表4可知：随着初始糖度的提高，菌草酒残糖和可溶性固形物含量逐渐升高；
菌草酒中的总酸含量和pH值逐渐降低；
菌草酒中的酒精度则呈逐渐上升的趋势.当初始糖度为16°Brix时，菌草酒酒精度最低，总酸含量和pH值最高，但口感最差，酒体浑浊，略有异味.当初始糖度为24°Brix时菌草酒口感最佳，酒体协调，外观呈草绿色，口感醇厚适口，余味舒适.当初始糖度为32°Brix时，得到的菌草酒酒精度最高，但酸度和口感不如初始糖度为24°Brix酿成的菌草酒，可能是因为当酒精含量过高时，酒体的酒精味重，刺激性强，掩盖了原料的草香味.但若酒精含量低，则口感寡淡无味.综合考虑各个影响因素[31]，确定菌草酒发酵的最佳初始糖度为24°Brix.
表4 初始糖度对菌草酒品质的影响Table 4 Effect of initial sugar degree on quality of JUNCAO wine
2.1.3 发酵温度对菌草酒品质的影响 选用安琪白酒曲作为酿酒酵母，在发酵初始糖度24°Brix、接种量0.3 g·L-1、发酵天数30 d的条件下，发酵温度对菌草酒品质的影响如表5所示.从表5可知：随着发酵温度的升高，菌草酒中残糖含量的变化较为显著；
5个温度梯度下菌草酒中的残糖含量和pH值呈现先下降再上升的趋势；
当发酵温度为27 ℃时，菌草酒中残糖含量最低；
当发酵温度为23 ℃时，菌草酒中残糖含量最高.低温造成菌草酒中残糖含量偏高的原因可能是酵母菌对低温不适应，进入休眠期，进而减慢甚至停止发酵.酵母菌的生长温度为25～32 ℃[32].周文亚等[33]在探究发酵温度对酿酒酵母菌株的影响时发现，在22～28 ℃，随着发酵温度的升高，酵母菌数量与发酵温度呈正相关，甘油含量升高对酒的辣感、酸酐起到平衡作用.刘洋[34]在对肉苁蓉酒的酿造工艺研究中发现较低的发酵温度会影响酵母菌繁殖，导致酵母菌的繁殖和降糖出现滞后.张鑫等[35]采用响应面法对无花果酒的酿造工艺进行优化，发现发酵温度偏低，不适合酵母菌的生长繁殖，会导致发酵周期延长、发酵不完全或代谢产物发生改变，进而对酒的品质产生影响.从表5还可以发现，酒精度和可溶性固形物含量呈先上升后下降的趋势，基本均维持在比较合理的水平.总酸含量总体呈现出逐渐升高的趋势，可能是因为温度升高会导致香气成分挥发，致使挥发酸、醛类等副产物大量生成.当发酵温度为27 ℃时，酒精度和可溶性固形物含量最高，得到的酒体色泽呈明亮的金黄色，酸甜可口，醇香浓郁协调，纯正无杂味，余味愉快，且有独特的清香味.由此可知最适宜菌草酒酿造的发酵温度为27 ℃.
表5 发酵温度对菌草酒品质的影响Table 5 Effect of fermentation temperature on quality of JUNCAO wine
2.1.4 酒曲接种量对菌草酒品质的影响 酒曲接种量会影响发酵周期[36].以安琪白酒曲作为酿酒酵母，在初始糖度24°Brix、发酵温度27 ℃、发酵天数30 d的条件下，酒曲接种量对菌草酒品质的影响如表6所示.从表6可知，随着酒曲接种量的增加，菌草酒中的残糖、pH值、酒精度和可溶性固形物含量均呈先下降后上升的趋势.可能是因为当酵母含量降低时，酵母生长的延迟期变长；
同时，发酵速度减慢，发酵过程容易受到其他杂菌的影响.当酵母增加到一定量时，酵母的呼吸作用逐渐增强，生长延迟期也缩短，同时被用于酵母的生长和繁殖的基质消耗量增大，导致酒精度下降.结果(表6)表明，当酒曲接种量为0.45 g·L-1时，酒精度达到最大值，且菌草酒具有菌草特有的清香味，醇香味较浓，色泽清澈，风味较佳.因此，确定菌草酒的最适酒曲接种量为0.45 g·L-1.
表6 酒曲接种量对菌草酒品质的影响Table 6 Effect of yeast inoculum dosage on quality of JUNCAO wine
2.1.5 发酵时间对菌草酒品质的影响 以安琪白酒曲作为酿酒酵母，在初始糖度24°Brix、发酵温度27 ℃、酒曲接种量0.45 g·L-1的条件下，发酵时间对菌草酒品质的影响如表7所示.从表7可知：菌草酒中的残糖含量在发酵初期下降较快，从第10天到第30天由21.6 g·L-1迅速降到8.1 g·L-1；
发酵30 d后残糖含量几乎不再下降.可能是因为随着发酵时间的延长，发酵罐中的氧气含量降低，使得酵母菌新陈代谢加快，酒精含量迅速提高；
当酒精达到一定浓度时，酵母菌的生长繁殖受到抑制，使得发酵停止，从而造成酒中的糖分残留[37].并且，随着发酵时间的延长，酒精度的变化趋势与酒中残糖含量的变化趋势正好相反，这与酒精度上升时总糖下降的变化规律相吻合.同时，总酸含量随发酵时间的延长逐渐上升，可能是因为原料中的糖在酵母的作用下转化成为乙醇.发酵前期酵母菌活性强，代谢活跃，因此乙醇的转化速率高；
发酵后期乳酸、醋酸菌等产酸菌大量生成有机酸，对酵母菌产生抑制作用，因此随着发酵时间的延长，总酸含量上升，pH值下降.本研究结果表明，可溶性固形物含量在发酵前期呈逐渐上升的趋势，但在第40天有所下降，可能是因为发酵液中的糖转化较完全，发酵基本接近终点.感官评分在发酵第10天至第30天逐渐增加，并且在第30天达到最大值；
在发酵第30天后感官评分逐渐降低.可能是因为随着发酵时间的延长，发酵罐中酸度和酒精度升高，导致口感酸涩和辛辣味较浓.综合考虑感官评价和成本因素，确定菌草酒的最佳发酵时间为30 d.
2.2 响应面试验
根据单因素试验结果，通过响应面试验对菌草酒的酿造工艺进行优化，选取初始糖度(A)、发酵温度(B)和酒曲接种量(C)3个因素，设置3个水平进行试验.以感官评价为响应值进行试验评价.以响应面法优化菌草酒发酵工艺的设计方案和响应值，结果如表8所示.
表7 发酵时间对菌草酒品质的影响Table 7 Effect of fermentation time on quality of JUNCAO wine
表8 响应面试验的设计方案和响应值Table 8 Response surface experimental design and response value
利用Design Expert 8.0.6对表8的数据进行多元回归方程拟合.以菌草酒的感官评分为响应值构建的菌草酒酿造工艺参数的二次回归模型为：
Y=84.40+6.38A-1.50B-1.87C-2.75AB-1.50AC-0.75BC-5.95A2-6.70B2-7.95C2
由表9可知回归模型中P值为0.031 3(P<0.05)，表明具有显著差异.失拟项P值为0.933 1(P>0.05)，表明无显著差异，即失拟项与纯误差之间差异不显著，说明二次回归模型显著，可用回归方程对试验结果进行分析和预测[38].
R2=0.850 5，校正后R2=0.858 4，说明此模型可以解释85.84%的响应值变化；
PredR2=0.565 9，信噪比=5.155>4，表明此模型拟合度好，试验误差小.
表9 回归系数及显著性检验1)Table 9 Regression coefficient and significance test
响应面越陡峭，说明该因素对试验结果的影响越显著[39].从图1可以看出，在所选范围内存在极值，坡度陡表明发酵温度与初始糖度之间的交互作用显著.从图2可以看出，响应面呈先升高后下降的趋势，表明酵母接种量与发酵温度之间有交互作用.由图3可以看出，随着酵母接种量的增加，感官评价变化不明显.由此可知，初始糖度对感官评价的影响大于酵母接种量.
图1 发酵温度与初始糖度对感官评价的响应面Fig.1 Effect of fermentation temperature and initial sugar degree on sensory quality by response
图3 酵母接种量与初始糖度对感官评价的响应面Fig.3 Effect of yeast inoculum dosage and initial sugar degree on sensory quality by response surface methodology
2.3 菌草酒的安全性
2.3.1 菌草酒微生物安全性指标 菌落总数是体现酒体生物安全性的一个重要指标.本研究结果表明：菌草酒中的菌落总数<10 cuf·mL-1，符合白酒中菌落总数≤50 cuf·mL-1的要求；
大肠菌群为0.01 MPN·mL-1，符合国标中大肠菌群≤0.03 MPN· mL-1的要求；
沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌均未检出，满足国标中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌等不得检出的要求.从检测结果可以看出，采用上述工艺发酵的菌草酒，符合国家对固态酿造白酒微生物的要求，说明该菌草酒是一种安全的发酵食品.
2.3.2 菌草酒理化和卫生指标 本研究结果表明，菌草酒的酒精度为52%，为高度酒.总酸含量为1.9 g·L-1，符合国家标准要求(≥0.30 g·L-1)；
总酯含量为2.31 g·L-1，符合国家标准要求(≥0.6 g·L-1)；
甲醇含量为0.04 g·L-1，符合国家标准要求(≤0.30 g·L-1)；
铅含量未检出，符合国家标准要求(≤0.5 mg·L-1).
2.3.3 菌草酒中黄曲霉毒素含量 菌草酒样品中黄曲霉毒素的检测结果如图4所示.从图4中可知:当黄曲霉毒素浓度为100.0 ng·mL-1时，T线不明显;当黄曲霉毒素浓度为12.5 ng·mL-1时，T线刚开始显现.表明菌草酒样品中黄曲霉毒素含量远低于12.5 ng·mL-1，菌草酒中的黄曲霉毒素符合国家标准要求(≤20 ng·mL-1).
本研究在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken响应面试验对菌草酒发酵工艺进行研究.本研究结果表明：
(1)选用安琪白酒曲作为酿酒酵母发酵得到的菌草酒的残糖含量最低，风味最好，因此选用安琪白酒曲作为酿造菌草酒的最佳酵母.
(2)在初始糖度为24°Brix时发酵得到的菌草酒口感最佳.在发酵温度为27 ℃时发酵得到的菌草酒的酒精度和可溶性固形物含量最高，感官评价分数最高.当酵母接种量为0.45 g·L-1时，酒精度达到最大值，且感官评价分数最高.感官评分在发酵第10天至第30天显著提高，并且在第30天达到最高值.
阴性对照不含黄曲霉毒素；
100.0和12.5 ng·mL-1是用混合黄曲霉毒素稀释后的浓度.图4 菌草酒样品中的黄曲霉毒素含量分析
(3)通过响应面试验对菌草酒的酿造工艺进行优化，最终确定菌草酒的最佳发酵工艺条件为：初始糖度24°Brix，发酵温度29 ℃，酵母接种量0.45 g·L-1.在此工艺条件下进行3次平行试验，得到的菌草酒感官评分为91分，与预测值差距较小.
(4)对菌草酒中微生物的安全性，理化、卫生指标和黄曲霉毒素含量进行检测，结果显示：菌落总数<10 cuf·mL-1，大肠菌群0.01 MPN·mL-1，沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌均未检出；
酒精度52% vol、总酸含量1.90 g·L-1，总酯含量2.31 g·L-1，甲醇含量0.04 g·L-1，铅未检出，黄曲霉毒素含量远低于12.5 ng·mL-1.得到的结果均符合国家标准，说明菌草酒是一种安全的发酵酒.成品菌草酒醇厚干爽，气味醇香，色泽透亮，酒体协调，有浓郁而独特的菌草香气，具有较好的推广价值.
