鳗鱼骨胶原蛋白ACE抑制肽的制备及性质研究
时间：2023-06-22 21:05:02 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
邵燕秋 ，黄 卉，李来好，杨贤庆，陈胜军，郝淑贤，吴燕燕，岑剑伟，邓尚贵
1. 浙江海洋大学 食品与药学学院，浙江 舟山 316022
2. 中国水产科学研究院南海水产研究所/国家水产品加工技术研发中心/农业农村部水产品加工重点实验室，广东 广州 510300
高血压是常见的慢性疾病，可引起心力衰竭、视力丧失或者肾脏疾病等[1]。全世界约有25%的成年人患有高血压[2]。血管紧张素转化酶 (Angiotensin-converting enzyme, ACE) 是一种含有锌离子 (Zn2+)的二肽羧肽酶[3]，通过催化无升血压活性的血管紧张素I (Angiotensin I, Ang I) 转化为具有升血压活性的血管紧张素II (Angiotensin II, Ang II)，并使具有血管舒张作用的缓激肽失活，从而导致血压上升[4]。血管紧张素转化酶抑制肽是具有降血压活性的生物活性肽。目前主要使用合成药物治疗高血压，如赖诺普利、卡托普利、依那普利[5]，会使人体产生如过敏和皮疹等不良反应[6]。食物蛋白来源的天然活性肽与合成药物相比，具有来源可靠、无明显不良副作用等优点[7]。因此从天然的食物蛋白源中制备具有ACE抑制活性的肽作为开发降血压药物的基础显得极为重要[8]。近年来利用水产蛋白制备具有ACE抑制活性的多肽逐渐受到关注，如从大黄鱼 (Larimichthys crocea)、龙须菜(Gracilariopsis lemaneiformis)、短鳍笛鲷 (Decapterus macrosoma)、环菱螺 (Bellamya bengalensis)、海参 (Acaudina molpadioidea)、狗母鱼 (Synodus macrops) 以及青蛤 (Cyclina sinensis) 等[1,8-13]来源中已提取出具有ACE抑制活性的多肽。
鳗鱼肉质细腻、营养丰富，有“水中人参”的美誉。中国是最大的鳗鱼养殖国，2020年中国鳗鱼养殖产量高达25.07万吨[14]。鳗鱼的加工产业主要是以烤鳗为主，烤鳗加工过程中会产生鱼骨、鱼头等副产物，目前副产物主要作为生产饲料的原料，附加值较低[15]。鱼骨含有丰富的胶原蛋白，具有较好的开发利用前景。因此，本研究从鳗鱼骨中提取胶原蛋白，采用不同蛋白酶酶解制备具有ACE抑制活性的多肽，通过单因素和响应面试验优化提取工艺条件，测定其分子质量分布及氨基酸组成，以期为鳗鱼骨胶原蛋白制备ACE抑制活性肽的研发和资源再利用提供理论依据和思路。
1.1 材料与试剂
鳗鱼鱼排购于广东顺德东龙烤鳗有限公司。
碱性蛋白酶 (≥200 U·mg−1)、胃蛋白酶 (≥10 000 U·mg−1)、木瓜蛋白酶 (≥200 U·mg−1)、中性蛋白酶(≥100 U·mg−1)、胰蛋白酶 (≥250 U·mg−1) 购于合肥博美生物科技有限公司；
细胞色素C (12 400 D)、抑肽酶 (6 511.44 D)、杆菌肽 (1 422.69 D)、氧化型L-谷胱甘肽 (612.63 D)、还原型谷胱甘肽 (307.3 D)购于北京睿博兴科生物技术有限公司；
ACE (≥2.0 U·mg−1) 购于上海源叶生物科技有限公司；
马尿酰-组氨酰-亮氨酸 (HHL) 购于南京娇子腾科学器材有限公司；
乙二胺四乙酸 (EDTA，分析纯) 购于广州都宏有限公司。
1.2 仪器与设备
THZ-C型台式恒温振荡器 (太仓华美生化仪器厂)；
H1850R型高速台式冷冻离心机 (湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；
α1-4型冷冻干燥机 (德国Christ公司)；
LC-20AD高效液相色谱 (日本岛津公司)。
1.3 试验方法
1.3.1 鳗鱼骨胶原蛋白的制备
参考钱跃威等[16]的方法加入质量分数为5%的氢氧化钠 (NaOH) 溶液浸泡鱼排约40 min除去附着的鱼肉；
参考蔡路昀等[17]方法加入0.5 mol·L—1乙二胺四乙酸二钠 (EDTA-2Na) 溶液浸泡鱼骨72 h，每12 h更换一次溶液，以除去矿物质。用蒸馏水反复冲洗、沥干后备用。
准确称取一定质量预处理过的鱼骨，料液质量体积比为1∶40，调节pH至2.0，胃蛋白酶加酶量为1% (质量分数)，在37 ℃下振荡提取2 h，灭酶，纱布过滤。在上清液加入氯化钠 (NaCl) 使溶液质量浓度为0.9 mg·mL−1，4 ℃静置过夜，6 000 r·min−1离心15 min，沉淀物即胶原蛋白粗品。用0.1 mg·mL−1的乙酸溶液复溶，调节pH至中性，在4 ℃ 下用 0.1 mg·mL−1乙酸溶液透析 1 d、去离子水透析2 d，每8 h换一次透析液。透析完成后将样品进行冷冻干燥，即可得到胶原蛋白样品，于—20 ℃ 下保存。
1.3.2 蛋白酶的筛选
将鳗鱼骨胶原蛋白溶于超纯水至质量浓度为5 g∙L−1，分别加入 3% (质量分数) 的木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶以及胃蛋白酶，根据表1的试验条件调节至各蛋白酶的最适pH和温度，酶解4 h。酶解结束后90 ℃以上灭酶15 min，冷却至室温后，离心、浓缩、冷冻干燥，得到胶原蛋白肽粉，进行ACE体外抑制活性测定。
表1 5种蛋白酶的最适酶解条件Table 1 Optimal enzymatic hydrolysis conditions of five proteases
1.3.3 单因素试验
以ACE抑制活性、水解度为评价指标，分别考察碱性蛋白酶的pH (7、8、9、10、11)、加酶量(1%、2%、3%、4%、5%，质量分数)、酶解时间(2、3、4、5、6 h) 以及胶原蛋白质量浓度 [1、5、10、15、20 g·L—1] 4 个因素对评价指标的影响。
1.3.4 响应面优化试验
在单因素试验的基础上，选择酶解时间 (A)、加酶量 (B) 以及pH (C) 为响应因素，以ACE抑制率为响应值，应用Box-Behnken Design 进行响应面优化试验 (三因素三水平)，因素和水平的具体参数见表2。
表2 响应面试验因素水平表Table 2 Response surface test factors and levels
1.3.5 水解度的测定
水解度 (DH) 指的是肽键在蛋白底物 (htot) 中裂解至总肽键的比例，采用pH-stat法测定[18-19]，在试验中通过加入标准的NaOH溶液保持水解过程中pH不变，通过计算滴定胶原蛋白水解所消耗的标准NaOH溶液体积来计算胶原蛋白的DH (%)：
式中：B为保持pH不变所消耗的NaOH体积(mL)；
Nb为 NaOH 的当量浓度 (mol·L−1)；
Mp为底物中蛋白总量 (g)；
htot为底物蛋白质中肽键总数(mmol·g−1)，本研究中 htot以 8.41[20]计；
α 为水解过程中α-氨基酸的解离度，其计算公式为：
式中：pH为水解液的酸碱度；
pK为α-氨基酸的解离常数。
1.3.6 ACE抑制活性测定
ACE抑制活性测定参考苏亿盛[19]的方法略作修改。将样品用 pH 8.3、0.1 mol·L−1硼酸盐缓冲液(含有 0.3 mol·L−1的 NaCl) 溶解。在 1.5 mL 离心管中加入 50 μL 样品溶液和 50 μL 5 mmol·L−1的HHL，于37 ℃恒温水浴锅中水浴5 min，再加入50 μL 0.1 U·mL−1的 ACE 溶液，于 37 ℃ 恒温水浴锅水浴 30 min，加入 100 μL 1 mol·L−1的盐酸 (HCl)终止反应。以硼酸盐缓冲液代替样品作为空白对照组。反应液离心后用高效液相色谱 (HPLC) 检测马尿酸生成量。
色谱柱：C18-WP，100 A，4.6×250 nm，5 μm；
流动相：乙腈 (含0.1%三氟乙酸)∶水 (含0.1%三氟乙酸) =25∶75 (体积比)，等度洗脱；
流速为0.5 mL·min−1；
检测波长为228 nm；
进样量为10 μL。ACE抑制活性按照公式 (3) 计算。
式中：IA为ACE抑制活性；
AS为加入抑制剂组中马尿酸的峰面积；
AC为空白对照组中马尿酸的峰面积。
1.3.7 酶解产物分子质量分布测定
采用高效体积排阻色谱法 ( High performance size exclusion chromatography, HPSEC) 测定酶解产物的分子质量 (Molecular weight, MW) 分布。参照Guo等[21]方法并略作修改。将冻干肽粉用超纯水溶解后配制成2 mg·mL−1溶液；
称取适量的还原型谷胱甘肽、氧化型L-谷胱甘肽、杆菌肽、抑肽酶以及细胞色素C用超纯水配置成2 mg·mL−1溶液，过0.22 μm微孔滤膜。据标准品的保留时间和相对分子质量的对数来分析样品的分子质量分布；
流动相：乙腈 (含0.1%三氟乙酸)∶超纯水 (含0.1%三氟乙酸)=20∶80 (体积比)；
等度洗脱；
流速为0.5 mL·min−1；
紫外检测波长为 214 nm。
1.3.8 氨基酸组成测定
参考GB 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》的酸水解法。
1.4 数据分析
单因素试验结果采用SPSS 26.0软件进行显著性差异分析，响应面优化试验采用Design Expert 8.0.6软件进行回归分析，所有数据采用Origin 2015软件进行作图。
2.1 蛋白酶的筛选
在鳗鱼骨胶原蛋白质量浓度5 g·L−1、加酶量3% (质量分数) 的条件下，于各蛋白酶的最适pH和温度下酶解4 h，并测定ACE抑制活性。不同蛋白酶对胶原蛋白的酶解效果差异明显，胃蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶酶解产物的ACE抑制活性分别为 (28.90±1.68)%、(52.75±1.75)%、(37.43±0.86)%、(23.52±4.02)%和 (6.86±1.46)% (图1)。其中碱性蛋白酶酶解鳗鱼骨胶原蛋白制备的酶解产物的ACE抑制活性最高，这可能是因为不同的蛋白酶具有不同的作用位点和酶解产物[22-23]。该结果与朱迎春等[24]的研究结果相一致，其使用5种蛋白酶对鲶鱼骨进行酶解，发现碱性蛋白酶酶解产物的ACE抑制活性最高 (89.10%)。此外，李华亮等[25]使用碱性蛋白酶酶解鳄鱼骨得到具有较好ACE抑制活性的多肽。因此，可选择碱性蛋白酶为最佳酶，并进一步优化制备条件。
图1 不同蛋白酶对ACE抑制活性的影响Fig. 1 Effect of different proteases on ACE inhibitory activity
2.2 单因素试验结果
pH的改变可影响底物和酶的解离状态，破坏酶的空间结构，引起酶活性部位构象的改变[26-27]。在pH 7～9范围内，ACE抑制活性逐渐增强，pH 9～11范围内ACE抑制活性逐渐降低，在pH 9时ACE抑制活性达到最高 (56.66%，图2-a)，因此pH 9是较为合适的酶解pH。
随着加酶量的增加，底物蛋白水解越充分，生成的小分子质量的肽也会增多，则ACE抑制活性逐渐增加，水解度逐渐增强，在加酶量为2%～3%(质量分数) 时，活性迅速增加并达到最大值54.59%(图2-b)。酶解液的ACE抑制活性随着酶添加量的增加呈现先升后降的趋势。当酶的添加量继续增加，酶会与底物继续反应，小分子多肽继续降解，因此导致酶解液的抑制活性下降。因此，加酶量为3% (质量分数) 时较为合适。
随着酶解时间的增加，ACE抑制活性先上升后下降，水解度逐渐上升后趋于平缓 (图2-c)。这是因为在初始阶段底物中蛋白浓度较高，酶与底物作用位点结合程度高，使底物蛋白迅速降解为肽段，水解程度也逐渐升高，长肽被水解为短肽，活性增强；
当水解程度达到饱和时，随着时间的增加，由于底物和酶的接触几率变小、酶切位点减少，从而导致水解程度逐渐变缓[28]。ACE抑制活性在第5 小时达到最大 (50.58%)，水解度为19.37%。因此，获得活性较高的酶解产物需要严格控制酶解程度，5 h为较适合的酶解时间。
当胶原蛋白质量浓度为5 g·L−1时，ACE抑制活性较低，当质量浓度升高时，水解度逐渐上升后趋于平稳，ACE抑制活性快速升高后趋于降低，当胶原蛋白质量浓度为15 g·L−1时ACE抑制活性最大 (60.45%，图2-d)。这是因为底物中蛋白浓度较低时，在反应过程中底物蛋白与酶的接触几率高，流动性强，提高了反应的速率；
当胶原蛋白质量浓度增大时，酶与底物的接触达到饱和，酶促反应不再增加，活性、水解度逐渐趋于平稳[29]。因此，较适合的酶解胶原蛋白质量浓度为15 g·L−1。
图2 pH、加酶量、时间、胶原蛋白质量浓度对水解度和ACE抑制活性的影响Fig. 2 Effects of pH, enzyme dosage, enzymatic hydrolysis time and collagen mass concentration on degree of hydrolysis and ACE inhibitory activity
2.3 响应面优化试验结果
2.3.1 响应面试验设计及结果
根据单因素试验结果，在酶解温度50 ℃、胶原蛋白质量浓度为15 g·L−1的条件下，以酶解时间(A)、加酶量 (B)、pH (C) 3个因素为自变量，ACE抑制率为响应值进行响应面试验，结果见表3。
表3 响应面试验设计和结果Table 3 Design and results of response surface experiment
运用Design Expert 软件，对以上17个试验点响应值进行二次回归分析，经回归拟合后，得到多元回归方程：
y=71.49+8.84A+1.44B+2.09C+1.12AB—5.04AC—0.21BC—15.89A2—8.18B2—2.02C2
2.3.2 回归模型的建立及分析
对试验结果进行多元回归分析，回归方程的方差分析结果见表4。模型的F值为27.19，P为0.000 1，表明模型具有显著性。酶解时间A以及二次项A2、B2对响应值的影响极显著 (P<0.001)；
交互项AC对响应值影响显著 (P<0.05)。失拟项F=2.72，差异不显著 (P>0.05)。表明该模型与碱性蛋白酶酶解鳗鱼胶原蛋白制备具有ACE抑制活性多肽的试验情况拟合程度较好。各因素对ACE抑制活性的影响程度排序为：酶解时间>pH>加酶量。
表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model
2.3.3 各因素之间互相作用分析
等高线的图形可反映交互作用的强弱，椭圆表示交互作用显著，圆形表示交互作用不显著[30]。图3为回归方程中的AB、AC、BC对应的响应面图，时间对ACE抑制活性的影响最为显著，pH和温度对其影响较小。时间和pH交互作用对ACE抑制活性影响显著，当加酶量为3% (质量分数)时，时间越长，ACE抑制活性随着pH的增加先升后降的趋势越明显；
加酶量与时间、加酶量与pH之间的交互作用不显著。
图3 各因素相互作用对ACE抑制活性的响应面及等高线图Fig. 3 Response surface and contour lines of various factors on ACE inhibitory activity
2.3.4 响应面优化验证
由软件分析得到碱性蛋白酶酶解鳗鱼骨胶原蛋白制备具有ACE抑制活性的多肽的工艺条件为温度50 ℃、胶原蛋白质量浓度为15 g·L−1、时间5.250 06 h、加酶量3.103% (质量分数) 、pH 9.202，预测活性值为72.87%。结合生产实际情况，将鳗鱼骨胶原蛋白酶解工艺条件调整为：温度50 ℃、胶原蛋白质量浓度为 15 g·L−1、时间 5.25 h、加酶量3.1% (质量分数) 、pH 9.2。在此条件下进行试验验证，其抑制率和水解度分别为 (70.33±0.9)%和23.98%，与模型的预测值接近。表明该回归模型对鳗鱼骨胶原蛋白水解条件的优化是可行的。
2.4 酶解产物分子质量分布
分子质量的大小对生物活性有很大影响，不同分子质量的肽段活性可能不同，一般小分子低聚寡肽易被人体吸收，能直接参与组织蛋白质合成和代谢[28]。鳗鱼骨胶原蛋白酶解产物的分子质量分布如图4所示，不同分子质量的肽含量占比为：<1 kD的为57.02%，1～3 kD的为36.55%，3～5 kD的为4.72%，>5 kD 的为1.71%。丘娟等[31]从牡蛎中制备得到具有较好ACE抑制活性的多肽，其分子质量在3 kD 以下的占比达到99.72%；
Yu等[13]采用超滤法对青蛤酶解液进行8 kD、5 kD、3 kD不同分子量的截留膜过滤，<3 kD的组分与其他组分相比具有较高的ACE抑制活性；
Shi等[32]和Kim等[33]分别从海马 (Hippocampus trimaculatus) 和鳕(Trichiurus lepturus) 中鉴定出ACE抑制活性较高的七肽 (721.39 D) 和五肽 (496.44 D)。这些研究表明，具有较高ACE抑制活性的多肽主要为小分子质量的肽[34]。本研究得到的酶解产物在3 kD以下的多肽占93.57%，表明ACE抑制活性可能主要来源于分子质量小于3 kD的肽。
图4 鳗鱼骨胶原蛋白酶解产物的高效体积排阻色谱图 (a) 及分子质量分布图 (b)Fig. 4 HPSEC chromatogram (a) of hydrolysates of eel bone collagen and its molecular weight distribution (b)
2.5 氨基酸组成分析
为了研究酶解前后氨基酸组成的变化，对胶原蛋白及酶解产物的氨基酸进行对比分析 (表5)。ACE抑制活性与氨基酸的疏水性有关，ACE抑制肽的C端是活性部位结合的关键，当C端含有疏水性氨基酸残基时更利于发挥ACE抑制活性[35-37]。其活性与疏水性氨基酸的含量和所在位置有关[38]。当N端为缬氨酸 (Val)、异亮氨酸 (Ile)，C端为色氨酸 (Trp)、酪氨酸 (Tyr)、脯氨酸 (Pro) 以及苯丙氨酸 (Phe) 时会增强ACE抑制活性[39]。酶解前后疏水性氨基酸 [Pro、丙氨酸 (Ala)、Val、蛋氨酸(Met)、Ile、亮氨酸 (Leu)、Phe] 含量分别为29.91%和32.31%，酶解后疏水性氨基酸Pro、Val、Ile、Leu以及Phe含量增加。Pro是发挥ACE抑制活性的重要氨基酸[40]，酶解后Pro的含量增加了4.94%。这与于志鹏等[41]从文蛤 (Meretrix lusoria) 中提取得到的具有ACE抑制活性的多肽结果相近。
表5 鳗鱼胶原蛋白氨基酸组成Table 5 Amino composition of collagen from eel bone
本研究采用5种蛋白酶对鳗鱼骨胶原蛋白进行酶解，以水解度和ACE抑制活性为评价指标，筛选出碱性蛋白酶为制备具有ACE抑制活性的多肽的最佳蛋白酶，通过单因素和响应面优化得到最佳酶解条件为：温度50 ℃、胶原蛋白质量浓度为15 g·L−1、时间 5.25 h、加酶量 3.1% (质量分数)、pH 9.2。在此条件下制备得到的酶解产物的ACE抑制活性为 (70.33±0.9)%；
酶解产物中分子质量小于1 kD的肽含量为57.02%，1～3 kD的肽含量为36.55%。疏水性氨基酸是发挥ACE抑制活性的重要氨基酸，酶解前后疏水性氨基酸含量分别为29.91%和32.31%，酶解后疏水性氨基酸Pro、Val、Ile、Leu以及Phe含量增加。结果表明，鳗鱼骨胶原蛋白是制备ACE抑制活性肽的较好来源，本研究的制备技术可为鳗鱼骨的加工利用提供参考。但由于其作用机理和生物学评价尚未明确，需要对其做进一步的序列鉴定和细胞实验来分析验证。
