磁共振扩散峰度成像评估荷人鼻咽癌裸鼠移植瘤乏氧及放疗效果
时间：2023-06-21 16:05:04 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
郑祥，郑德春，陈韵彬，王淋，陈加优，廖江，陈伟波
1.福建医科大学肿瘤临床医学院，福建省肿瘤医院放诊科，福建 福州 350014；
2.福建医科大学肿瘤临床医学院，福建省肿瘤医院中心实验室，福建 福州 350014；
3.飞利浦医疗公司（中国，上海），上海 200070；
*通信作者 郑祥 skipskip@sina.com
部分鼻咽癌患者存在放疗效果不理想或放疗后复发现象，可能是这部分患者肿瘤对射线的反应相对不敏感所致。研究表明，复发的鼻咽癌病灶存在明显乏氧情况[1]，并且肿瘤乏氧在调节鼻咽癌放射敏感程度中起到重要作用[2]。乏氧诱导因子-1（hypoxiainducible factor-1，HIF-1）可以反映肿瘤的乏氧情况，由于其中的HIF-1α氧调控亚基在正常组织中几乎不表达，而在肿瘤组织乏氧区域中表达增高，成为检测肿瘤乏氧的重要指标，当其活性被抑制后，鼻咽癌的肿瘤活性明显被抑制[3]；
而对其下游靶标血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）进行抑制也有利于提高鼻咽癌放疗疗效[4]。在治疗早期对鼻咽癌乏氧程度进行准确检测有利于预测肿瘤的放射敏感程度及治疗效果，从而及时有效地对预测疗效不佳患者进行治疗策略调整，是提高鼻咽癌放疗疗效的关键问题之一，也是亟待解决的问题。
扩散峰度成像（diffusion kurtosis imaging，DKI）是在传统扩散加权成像（DWI）基础上发展而来的扩散成像新技术。它基于水分子扩散运动呈非高斯分布的假设，并获得多个影像学参数。其中D值为校正过的扩散系数，比DWI的表观扩散系数更能精确地反映水分子在肿瘤组织内的实际扩散情况；
K值为表征组织各向同性程度的参数，可以反映肿瘤组织微环境情况。结合D值与K值能够较好地评估肿瘤细胞密度、细胞外间隙等微环境改变[5]。已有研究发现DWI可作为一种预测鼻咽癌治疗效果的可靠、无创的检查方法[6]，而DKI在肿瘤分级及疗效评估中较DWI更具优势[7-9]。本研究拟探讨DKI早期评估荷人鼻咽癌裸鼠移植瘤乏氧及其放疗效果的应用价值。
1.1 动物模型建立 使用72只4周龄免疫功能缺陷型雄性Balb/C裸鼠（中国人民解放军联勤第900医院实验动物中心提供）。取对数生长期的鼻咽高分化鳞状细胞癌细胞（CNE-1）系或鼻咽低分化鳞状细胞癌细胞（CNE-2）系细胞悬液0.1 ml（密度 1.0×107/ml，福建省肿瘤医院中心实验室提供），接种于裸鼠左前肢腋部。待移植瘤直径达到1.5 cm时视为成瘤达标。将裸鼠分为CNE-1和CNE-2组，每组36只。然后将每组裸鼠随机分为6个亚组进行照射治疗。
1.2 分割照射方案 将CNE-1及CNE-2组裸鼠各自随机分成6组，每组6只，分别为：G0组，未照射；
G1组，照射10 Gy（接受1/3照射量）；
G2组，照射20 Gy（接受2/3照射量）；
G3组，照射30 Gy（接受全部照射量）；
G4组，全剂量照射后第3天；
G5组，全剂量照射后第5天。本研究使用线性加速器，射线电压6 MVX，剂量率350 U/min，源皮距离100 cm，照射野大小3 cm×3 cm。每只裸鼠单个时间点接受剂量为10 Gy。
1.3 MRI检查与分析 所有小鼠均行飞利浦Achieva TX 3.0T MR扫描，使用小鼠专用扫描线圈。MRI扫描序列以及参数见表1，完成MRI扫描大约耗时16.3 min。G0组未接受任何X线照射，直接行MRI扫描；
G1～G3组分别于接受10、20和30 Gy照射后隔日进行MRI扫描；
G4、G5组分别于接受全剂量照射（30 Gy）后第3、5天进行MRI扫描。使用飞利浦EWS后处理工作站，IDL 6.3软件进行数据后处理分析和测值。由2名副主任医师采用双盲法进行裸鼠移植瘤的DKI后处理分析测值。首先在T2WI形态学图像上沿病灶周边手动勾画感兴趣区，勾画时尽量与病灶边缘适形并尽量避开病灶内液化坏死区，然后将所勾画的感兴趣区依次拷贝至D图、K图进行分析运算，并自动生成相应的DKI参数值（图1）。2名医师分别测量肿瘤长径、体积、D值和K值，最终取平均值为所得参数值。计算体积退缩率：体积退缩率=（初始体积−检测时间点体积）/初始体积×100%。
图1 CNE-2系DKI荷人鼻咽癌裸鼠移植瘤参数。A～E分别为DWI（b=800 s/mm2）、S0、D、K及R2图；
A中的红圈为勾画的感兴趣区
表1 MRI扫描参数
1.4 乏氧相关指标分析 完成MRI扫描后处死荷瘤裸鼠，完整剥离瘤体组织，分别取部分组织存放于−75℃冰箱以及RNA保存液中保存备用，采用RTqPCR和免疫组化检测乏氧相关指标HIF-1α和VEGF表达，具体方法参照本课题组前期实验[10]。
1.5 统计学分析 使用SPSS 20.0软件，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法分析。两系移植瘤每个时间点的DKI参数比较使用独立样本t检验。采用Pearson相关分析检测DKI指标与肿瘤长径和乏氧相关生物标志物之间的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 放疗过程中瘤体大小及体积退缩率的变化 经过照射后，两系移植瘤长径和体积退缩率均出现不同程度退缩，且CNE-2组缩小更明显。接受10 Gy剂 量（G1组）时，两系移植瘤的退缩率差异无统计学意义（P=0.332），接受20 Gy剂量（G2组）后，两系移植瘤的退缩率差异有统计学意义（P=0.032），见表2。
表2 CNE-1和CNE-2移植瘤放疗过程中的退缩情况（±s）
表2 CNE-1和CNE-2移植瘤放疗过程中的退缩情况（±s）
组别 退缩率（%） t值 P值 长径（mm） t值 P值 CNE-1 CNE-2 CNE-1 CNE-2 G0 - - - - 12.83±1.16 13.33±4.26 7.53 0.367 0.334 G2 6.06±2.61 27.71±1.34 −18.08 0.032 11.75±2.31 9.16±4.06 6.38 0.046 G1 3.02±1.72 7.06±1.12 −4.81 0.332 12.05±1.47 12.31±2.06 5.82 0.012 G4 28.03±1.82 44.07±1.25 −22.82 <0.001 10.97±1.97 6.50±1.64 4.88 0.003 G3 18.73±1.80 36.28±1.35 −19.09 0.004 11.35±1.31 7.18±3.97 5.92 G5 34.67±1.16 64.14±1.52 −37.72 <0.001 10.06±1.84 5.17±1.17 5.65 <0.001
2.2 放疗过程中DKI参数的变化 放疗过程中两系移植瘤的DKI参数D（CNE-1：F=4.647，P=0.003；
CNE-2：F=162.360，P<0.001）和K（CNE-1：F=18.903，P<0.001；
CNE-2：F=261.487，P<0.001）的动态变化差异有统计学意义。
CNE-1系移植瘤的D值在G0～3各组间以及G2～4各组间两两比较差异均无统计学意义（P>0.05），其余各组间两两比较差异均有统计学意义。CNE-2系移植瘤组内除G1和G2（P=0.191）外，其余每个照射时间点两两比较D值差异均有统计学意义（P<0.05）。CNE-1系移植瘤的K值在G0～2各组间两两比较差异无统计学意义（P=0.07），其余各组间两两比较差异均有统计学意义。CNE-2系移植瘤G0～4各组间K值两两比较差异均有统计学意义（P<0.001），其余各组间两两比较差异均无统计学意义。
两系移植瘤D值的差异首先出现在G1（P=0.019），K值首先出现在G0（P=0.009），均早于肿瘤体积退缩率产生显著性差异的时间点，见表3。
表3 放疗过程中移植瘤DKI参数的变化
2.3 放疗过程中乏氧相关因子表达的变化 照射后CNE-1移植瘤中HIF-1α、VEGF的mRNA和免疫组化阳性细胞表达水平均增加（图2），差异有统计学意义（HIF-1α：1.0±0～5.79±2.35、60.52±4.55～166.20±24.55，VEGF：1.0±0～4.17±1.88、77.47±6.03～165.51±39.37；
F=173.432、265.687，198.682、152.419，均P<0.001）。在CNE-2移植瘤中，HIF-1α、VEGF的mRNA和阳性细胞表达首先增加，然后突然减少（G3组），之后再次增加（图3）。
图2 放疗过程中移植瘤HIF-1α和VEGF的表达变化。A、C分别为照射期间移植瘤HIF-1α mRNA和免疫组化阳性细胞的表达；
B、D分别为照射期间VEGF mRNA和免疫组化阳性细胞的表达；
两系移植瘤G0组（HIF-1α和VEGF）mRNA的表达均设为1
图3 CNE-2移植瘤HIF-1α、VEGF放疗中G0、G3和G5时间点的免疫组化染色。A～C分别为G0、G3和G5组中的VEGF表达情况；
D～F分别为G0、G3和G5组中HIF-1α表达情况；
可见表达阳性细胞，表现为均匀深染（黄色或棕色，箭）
2.4 DKI参数与乏氧相关因子的相关性 两系移植瘤D值与肿瘤长径的变化呈负相关（P<0.001），K值与肿瘤长径的变化呈正相关（P<0.001）。CNE-1移植瘤的所有影像学参数均与HIF-1α和VEGF表达相关（P<0.001）。K值与CNE-2移植瘤的HIF-1α和VEGF表达相关（P=0.003，P<0.001），而D值与HIF-1α和VEGF的相关性弱（表4）。在两系移植瘤中， K值与乏氧相关因子的相关性均高于D值。
表4 DKI序列参数与乏氧相关因子表达的相关性
3.1 DKI与肿瘤放射敏感性 DKI基于水分子在体内扩散遵循非高斯分布的假设。与传统DWI序列相比，DKI获得的成像参数可以更准确地反映水分子在肿瘤组织中的实际扩散情况，进而反映肿瘤微循环的微环境、细胞密度、细胞外间隙等。研究表明，DKI用于乳腺肿瘤良恶性鉴别具有较好的应用价值[11]，其原因为D值反映水分子在组织中的真实扩散状况，比表 观扩散系数更准确[12]。K值代表水分子扩散偏离正态分布的程度。一项利用DKI早期评估多西他赛对诱导性大鼠卵巢癌疗效的研究显示，DKI参数尤其是K值的评估能力优于肿瘤形态学变化[13]，与本研究结果类似。本研究中两系移植瘤出现D值和K值显著差异早于肿瘤形态学，表明DKI用于早期预测肿瘤放射敏感性具有可行性。
肿瘤放射敏感性降低（主要为肿瘤乏氧以及由此激活的肿瘤微血管生成）是鼻咽癌复发的主要因素[14]。恶性肿瘤在乏氧环境下对辐射的抵抗力是常氧环境下的2～3倍[15]。此外，肿瘤微血管生成还可导致特定微环境中肿瘤细胞的一系列代偿，最终可能导致侵袭性肿瘤表型的形成以及其放射敏感性降低[16]。DKI可有效区分具有不同放射敏感性的鼻咽癌移植瘤，并识别出放射不敏感的鼻咽癌移植瘤[10]，因此DKI参数与乏氧相关指标之间可能存在某种潜在关系。基于以上结果和假设，本研究进一步应用DKI的参数D和K检测移植瘤放疗过程中HIF-1α和VEGF的表达，探求DKI序列检测放射不敏感鼻咽癌移植瘤的潜在机制。
在放射治疗初期，肿瘤细胞外间隙因细胞水肿而缩小，从而导致细胞外间隙水分扩散受限，进而导致D值下降和K值增加。随着辐射剂量增加，肿瘤细胞激活Caspase 3通路并介导肿瘤细胞凋亡[17]，进而导致细胞外间隙扩大。最后各向异性（峰度）的扩散也随着细胞间隙的加速扩大而迅速下降，并更加趋于各向同性[18]，最终引起D值大幅增高和K值明显下降。低放射敏感性（CNE-1）移植瘤中肿瘤细胞及其细胞外间隙的变化不明显，D值和K值的变化也不如高放射敏感性（CNE-2）移植瘤明显。这种情况与放疗过程中肿瘤大小的消退情况相似并存在相关性，也是DKI用以评估鼻咽癌放疗疗效的理论基础。
3.2 DKI与乏氧相关因子 辐射会导致肿瘤中HIF-1α表达水平增加[19-20]，这种表达上调最早发生于放疗后24 h，最长可持续1周。HIF-1α的下游靶标VEGF也会随之上调，与这种效应一致[20-22]。本研究中CNE-1移植瘤的HIF-1α和VEGF在照射后立即上调并呈持续增加趋势，而CNE-2移植瘤的情况则较为复杂。在接受全剂量辐射的G3时间点后，可以观察到HIF-1α和VEGF表达突然下降。这是因为高放射敏感性的移植瘤接受一定剂量的射线后细胞开始大量凋亡，导致正常肿瘤细胞明显减少，进而显著降低HIF-1α和VEGF的表达。因此，两系移植瘤的影像学参数和乏氧相关指标之间的相关性也存在显著差异。
鼻咽癌病灶中去泛素酶USP44的低表达使肿瘤放射敏感性降低，并使其放疗效果较差，且易于复发[23]，与本研究结果相似，当移植瘤接受照射时，高放射敏感移植瘤（CNE-2）的体积退缩率比低放射敏感移植瘤（CNE-1）更大，其原因为在放射敏感性较高的移植瘤中，大量肿瘤细胞在辐射过程中凋亡，而过多的凋亡细胞会大幅度降低乏氧相关指标的表达，并导致肿瘤微环境的剧烈变化，最终影响影像学参数与乏氧相关指标之间的相关性。本研究中CNE-1移植瘤放疗期间其HIF-1α和VEGF表达均与DKI参数显著相关，而在CNE-2移植瘤中，两种乏氧相关指标和DKI参数之间的关系弱得多。这表明CNE-2移植瘤照射后微观结构变化的机制比CNE-1移植瘤更为复杂。这种现象可能是DKI序列预测肿瘤乏氧的潜在基础。
本研究的局限性为：首先，本研究是动物实验，所得实验结论均需要通过临床研究进一步确认。其次，在照射期间肿瘤组织凋亡坏死较多，尤其是在高放射敏感性的CNE-2移植瘤中这种现象更明显，而过多的细胞凋亡影响了HIF-1α和VEGF表达检测的准确性，从而影响DKI参数与乏氧相关生物标志物相关性的分析。这些问题将在进一步研究中加以解决。
总之，DKI参数D值和K值均具有早期检测肿瘤放疗疗效的潜在能力，还可以反映低放射敏感性鼻咽癌移植瘤中HIF-1α和VEGF的表达。对于高放射敏感性鼻咽癌移植瘤，K值反映两种乏氧相关指标表达的能力强于D值。因此，K值比D值更适合应用于鼻咽癌移植瘤乏氧相关因子表达的检测和移植瘤放疗疗效的评估。
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