静脉注射免疫球蛋白治疗对复发性流产患者的外周血自然杀伤细胞及妊娠结局影响的Meta分析
时间：2023-06-19 13:10:05 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
陈远莹，黄伟育，杨一华
(广西医科大学第一附属医院生殖医学中心，南宁 530021)
在国外，复发性流产(RSA)是指从受孕到24周的妊娠期发生≥2次流产，约占怀孕女性1%～2%；
而在我国，则是指与同一性伴侣连续发生≥3次流产[1-2]。RSA在育龄期妇女中的发生率约为1%～5%，其中约50%的患者病因不明[3]，这些不明原因的RSA大部分与免疫紊乱有关。母胎界面免疫失衡可能是导致RSA的原因之一。在孕早期，自然杀伤(NK)细胞约占母胎界面免疫细胞数量的70%～80%[4]，对维持母胎界面的免疫耐受起着重要作用。有研究表明，外周血NK细胞活性及比例的升高与RSA患者的不良妊娠结局有关[5]。
近年来，免疫治疗越来越多地用于治疗病因不明的RSA，但其疗效及安全性仍存在争议。静脉注射免疫球蛋白(IVIG)是目前采用的免疫治疗方法之一，尤其是适用于外周血NK细胞数量增多的RSA患者[6]。有研究认为，RSA患者经过IVIG治疗后外周血NK细胞数量、活性、各表型比例发生改变，从而有利于改善妊娠结局[7-8]。但也有部分研究认为，IVIG治疗对妊娠结局无显著影响[9-10]。鉴于目前IVIG治疗RSA的研究存在治疗方案不统一、结论不一致的情况，难以指导临床实践。因此，本研究拟采用Meta分析方法，客观地评价IVIG治疗RSA的临床效果，以期为临床实践提供更有价值的参考。
一、文献检索
检索Pubmed、Web of Science、Embase、Cochrane Library、中国知网(CNKI)数据库；
检索日期自建库至2022年4月。英文数据库检索以“自由词”和“主题词”结合检索。中文数据库在中国知网上进行检索。中文检索词包括：复发性流产、反复流产、习惯性流产、静脉注射免疫球蛋白、自然杀伤细胞；
英文检索词包括：Recurrent Miscarriage、Recurrent Pregnancy Loss、Abortion、Habitual、Recurrent Abortion、Recurrent Spontaneous Abortion、IVIG、Intravenous Immunoglobulin、NK Cell、Natural Killer Cells、CD56、CD16。
纳入标准：(1)随机对照试验(RCT)、队列研究、无对照组的单臂试验研究；
(2)以IVIG治疗RSA；
(3)评价IVIG治疗前后NK细胞数量/活性的变化、活产率、流产率及不良反应。
排除标准：(1) 病例报告、综述、会议摘要；
(2)体外研究；
(3)数据资料不完整；
(4)用药方案不具体。
二、研究方法
1.原始文献的筛选及数据提取：由2名研究人员独立完成对文献的质量评价及数据提取。采用Prisma流程进行文献筛选，阅读文章的标题和摘要排除重复和不相关的研究。阅读剩余文章的全文，根据纳入排除标准确定纳入的文献。随后提取以下数据：(1)文献一般信息；
(2)研究对象一般情况；
(3)干预措施(用药剂量、开始用药时机、疗程等)；
(4)结局指标(IVIG治疗前后NK细胞数量/活性的变化、活产率、流产率及不良反应)。文献筛选及数据提取遇到分歧时，请教专家并讨论以达成一致。
2.文献质量评价：采用Cochrane风险偏倚评估工具评价随机对照研究(RCT)的文献质量和偏倚风险[11-12]，评价标准包括，随机分配方法、分配方案隐藏、施者与参与者的盲法、结果评估的盲法、结果数据完整性、选择性报道、其他偏倚。每一项的偏倚分为“低风险”、“可能存在风险”或“高风险”，除了评估每项的偏倚，还需要进行整体的偏倚评估，如果每项偏倚评估均为低风险，则整体偏倚评估为低风险，为高质量文献；
如果每项均未被评估为高偏倚风险，但任一项的评估结果为可能存在风险，则整体评价为可能存在风险，为中质量文献；
如果任一项被评估为高偏倚风险，或多项的评估结果为可能存在风险且对研究结果的可信度影响较大，则整体评价为高风险，为低质量文献。
采用纽卡斯尔-渥太华量表(NOS)评价队列研究[13-14]，NOS评估分为8个特定项目的3个质量参数(选择、可比性和结果)。NOS评价范围从0～9颗星。除了与可比性相关的项目允许分配2颗星之外，量表上的每个项目最多可获得1颗星。满分9分，<4分为低质量文献，4～6分为中等质量文献，7～9分为高质量文献。
采用Minors量表评价无对照组的单臂试验研究[15]。Minors量表的最终版本包含12个项目，前8个项目专门用于非比较研究，比较研究则需要包括全部项目。各项目得分“0”为未报告，“1”为报告但不充分，“2”为报告且充分，非比较研究的总分数为16分，总得分越多，研究的质量越高。
三、统计学方法
采用RevMan5.4.1统计软件进行Meta分析。采用I2检验进行异质性分析，若I2<50%时，认为异质性较小，选用固定效应模型进行分析；
若I2>50%时，认为多个独立研究的结果有高度异质性，分析异质性产生原因，并根据不同的给药时间进行亚组分析，对无法消除异质性的文献用随机效应模型合并分析。以P<0.05和95%可信区间(95%CI)表示差异有统计学意义。发表偏倚通过采用“倒漏斗”图形分析法进行评估。
一、文献检索及筛选流程图
通过检索初步得到的研究文献有1 004篇，其中，中文文献227篇，英文文献777篇。阅读文献题目及摘要剔除重复，排除文献968篇，对剩余的36篇文献通过阅读全文复筛，排除文献22篇，最终筛选出14篇文献[16-29]，检索及筛选流程见图1。
图1 文献筛选流程及结果
二、纳入研究基本特征
纳入的14篇文献[16-29]，共包含1 393例患者，其中564例采用了IVIG治疗、336例采用脂肪剂治疗、416例不干预或采用安慰剂治疗。其中，12项研究[16-26，28]研究了IVIG治疗RSA患者外周血NK细胞数量变化；
6项研究[19，22，25-27，29]研究了IVIG治疗RSA患者外周血NK细胞活性变化；
11项研究[16，18，20，22-29]报告了IVIG治疗RSA患者的活产率及流产率，其中4项研究[16，18，20，22]在治疗组为IVIG治疗而对照组为不干预或安慰剂治疗的情况下，研究了RSA患者的活产率及流产率(表1)。
表1 纳入文献的基本特征
三、纳入文献的质量评价
本Meta共纳入14篇文献[16-29]，其中RCT文献4篇[16，21，24-25]，根据Cochrane风险偏倚评估工具评分均为中质量文献(图2)；
队列研究6篇[17-20，22-23]，根据NOS评分，其中4篇[17，19-21]为中质量文献，2篇[18，22]为高质量文献(表2)；
单臂研究4篇[26-29]，根据Minors量表评分，3篇[26-28]总分为13分，1篇[29]总分为14分，均为高质量文献(表3)。因中质量文献为RCT或队列研究，高质量文献多数为单臂研究，少数为队列研究，所以纳入的文献对本Meta的结果稳定性造成一定程度的影响。
图2 RCT研究的质量评价
表3 单臂研究的质量评价
四、Meta分析结果
1.外周血NK细胞数量：纳入的文献中有12篇[16-26，28]文献探讨了外周血NK细胞数量。经整体异质性检验I2=94%，即纳入12项研究具有显著异质性，故选择随机模型分析方式，其整体检验结果为[I2=94%，95%CI(3.25，6.44)]，合并区间完全位于无效线右侧，即具有显著差异(Z=5.96，P<0.05)。故根据两次检测外周血NK细胞数量期间不同的给药时间来进行亚组分析，Meta分析结果显示：一次性IVIG给药治疗(1～5 d)的RSA患者，治疗后外周血NK细胞数量均显著低于治疗前[I2=22%，95%CI(1.99，3.82)，P<0.05]；
连续IVIG给药的RSA患者，无论是治疗至孕12周左右[I2=56%，95%CI(6.46，8.27)，P<0.05]，还是治疗至孕中晚期(26～34周)[I2=64%，95%CI(1.15，6.51)，P<0.05]，治疗后外周血NK细胞数量均显著低于治疗前(P<0.05)(图3)。
2.外周血NK细胞活性：纳入的研究中有6篇[19，22，25-27，29]探讨了外周血NK细胞活性。经整体异质性检验I2=64%，即纳入6项研究具有显著异质性，故采用随机效应模型进行分析。Meta分析结果显示，IVIG治疗后NK细胞活性显著低于治疗前[I2=64%，95%CI(4.30，12.07)，P<0.05](图4)。
3.活产率：纳入的研究中有4篇[16，18，20，22]探讨了IVIG治疗RSA后活产率的变化情况。经整体异质性检验I2=0%，异质性较小，采用固定模型进行分析。Meta分析结果显示，IVIG治疗组的活产率显著高于不干预或安慰剂治疗组[I2=0%，95%CI(3.70，8.56)，P<0.05](图5)。
4.流产率：纳入的研究中有4篇[16，18，20，22]探讨了IVIG治疗RSA后流产率的变化情况。经整体异质性检验I2=0%，异质性较小，故采用固定模型进行分析。Meta分析结果显示，IVIG治疗组流产率显著低于不干预或安慰剂治疗组[I2=0%，95%CI(0.12，0.27)，P<0.05](图6)。
5.用药安全性：纳入的研究中有5篇[16，18，20，25-26]文献报告了IVIG治疗的不良反应。其中，Morikawa等[26]研究报道了2例头痛、2例红斑及2例瘙痒。Meng等[25]研究报道了5例轻度发热，2例头痛。刘冬玲等[20]研究报道了6例恶心、26例注射侧上肢疼痛、5例头痛及3例胸闷。岑振考等[16]研究报道了9例轻微性头痛。雷蕾等[18]研究报道了2例头痛及1例胃肠道反应(表4)。
图3 IVIG治疗后改善外周血NK细胞数量的Meta分析
图4 IVIG治疗后改善外周血NK细胞活性的Meta分析
图5 IVIG治疗后改善活产率的Meta分析
图6 IVIG治疗后改善流产率的Meta分析
表4 IVIG治疗后不良反应发生情况[n(%)]
五、文献偏倚性分析
对纳入研究数量≥10且异质性大(I2>50%)的结局指标(外周血NK细胞数量)检测发表偏倚，结果可见漏斗图中各散点分布呈现不对称分布，提示该结局指标Meta分析纳入的文献存在发表偏倚或其他偏倚(图7)。
图7 IVIG治疗后外周血NK细胞数量变化的漏斗图
RSA的病因主要包括染色体异常、子宫解剖结构异常、内分泌紊乱、感染、遗传因素、免疫因素和血栓前状态等。免疫因素是导致RSA的主要原因之一。目前RSA的免疫治疗主要包括IVIG，宫腔注射免疫药物或制剂，如粒细胞集落刺激因子、脂肪乳剂、外周血单个核细胞，或口服糖皮质激素、环孢素、羟氯喹等[6]。IVIG开始是被用作免疫缺陷个体的替代疗法。IVIG 制剂的主要成分是血清IgG，它是从数千名供体中汇集而成的，现主要用于治疗自身免疫性疾病和炎症性疾病，如免疫性血小板减少症、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病、川崎病和格林-巴利综合征等[30]。IVIG可以影响Th1/Th2细胞因子比率并使之向Th2反应转变，增加调节性T细胞(Tregs)并减少Th17，同时阻断抗HLA抗体的功能，防止补体激活，并下调不同免疫细胞表面的刺激性Fc受体(FcgRI和FcgRIII)和上调抑制性受体(FcgRIIB)[31-32]。此外，IVIG还可以通过降低NK细胞数量、细胞毒性和增加NK抑制受体来改善妊娠结局[22，33]。
NK细胞是母胎界面的主要免疫细胞，子宫蜕膜中包含大量的NK细胞，在维持母胎界面免疫耐受中起重要作用。NK细胞通过产生粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子α等细胞因子，生产特定的趋化因子如白细胞介素-8、干扰素诱导蛋白-10和基质细胞衍生因子1，表达血管生成素1、血管生成素2、血管内皮生长因子-C以及转化生长因子-1等血管生成因子，促进子宫内膜蜕膜化、促进血管生成及子宫螺旋动脉重塑、促进滋养细胞侵袭，从而维持母胎界面的免疫耐受，增加妊娠成功的可能[34-36]。NK细胞具有独特的表型特征，外周血NK细胞的表型绝大多数为CD56dimCD16+，少部分为CD56brightCD16+或CD56brightCD16-；
而子宫内膜NK细胞(dNK)的表型主要是CD56brightCD16-，少数为CD56brightCD16+；
CD56dim型NK细胞比CD56bright型NK细胞有更大的细胞毒性，而CD56bright型NK细胞较CD56dim型NK细胞分泌功能更强[37-40]。因此，dNK相较于外周血NK细胞具有细胞毒性低、细胞因子产生能力强的特点。有研究认为，IVIG治疗可以通过改变NK细胞数量及活性等来改善RSA患者的妊娠结局[7-8]，而部分研究认为，IVIG治疗对妊娠结局无益[9-10]。因此，通过Meta分析对存在争议的研究进行合并以期得出较为合理的结论。
研究表明，RSA患者外周血NK细胞数量及活性显著高于正常妇女[38-39]。Wang等[40]利用单细胞 RNA测序比较了正常妊娠和不明原因RSA患者在妊娠早期蜕膜和外周白细胞的细胞和分子特征，研究发现，与正常妊娠的患者相比，RSA患者促炎状态明显增强，支持胚胎生长的蜕膜NK1细胞(dNK1细胞)比例显著降低，而具有细胞毒性和免疫活性特征的dNK3细胞比例显著增加，同时，因高表达“记忆”NK细胞的标记基因LILRB1而被认为参与不明原因RSA反复不良妊娠结局的dNK4细胞比例也显著增加。由以上结果推测，dNK1细胞百分比增加，dNK3细胞及dNK4细胞的百分比减少可能对妊娠结局有益。IVIG治疗有抗炎及免疫调节作用[30，41]，通过降低外周血NK细胞数量及毒性来改善妊娠结局[7-8，22]。王柳柳等[42]研究发现，IVIG治疗后的有反应组(外周血NK细胞比例较治疗前下降≥15%)的活产率显著高于无反应组(外周血NK细胞比例较治疗前下降<15%)。本Meta研究结果表明，IVIG治疗能显著降低外周血NK细胞数量及活性，显著提高活产率、并显著降低流产率。这可能是由于IVIG治疗减轻了RSA患者的炎症反应，降低了部分蜕膜NK细胞(dNK细胞)亚型的数量与毒性，从而提高了RSA患者的活产率、降低流产率。目前，关于外周血NK细胞与dNK细胞的关系仍不是非常清楚。有研究发现，dNK细胞由外周血NK细胞招募而来[43]，流产时RSA患者外周血NK细胞变化情况能反映流产期间dNK细胞的变化[44-45]，但以上结论证据较少且机制不明。另外一些研究则认为，外周血NK细胞和dNK细胞无显著相关性[46-47]。由于内膜活检为有创操作，关于IVIG治疗前后dNK细胞改变相关的研究较难以进行，因此，IVIG治疗RSA，虽然其外周血NK细胞数量及活性变化显著，但没有足够的证据能够表明dNK细胞与外周血NK细胞成正相关。
由于IVIG治疗RSA对改善外周血NK细胞数量的Meta分析存在较大的异质性(I2=94%)，本Meta分析按不同的用药疗程进行了亚组分析，降低了各亚组间的异质性(各亚组I2分别为22%、56%、64%)，说明不同的研究方案是异质性的来源。但是，本Meta分析仍存在一些局限性，如纳入的文献质量中，中质量文献较多，高质量较少；
纳入多种文献类型，异质性较大；
总样本量不大，关于活产率及流产率的样本量更少。这是由于在筛选文献的过程中发现，阴性结果的文献较少，有部分阴性结果的文献无法提取数据，致使样本量更少且存在偏移。由于大部分纳入的文献是在确定妊娠后给予IVIG治疗，因此不能分析IVIG治疗RSA能否提高妊娠率。
总之，虽然本Meta分析结果显示，IVIG治疗有利于改善RSA患者的妊娠结局，可以在符合适应证人群应用。但因本研究纳入多种类型的研究、异质性大、总样本量不大等局限性，因此本Meta分析结论需谨慎解读，仍需大规模、多中心的高质量RCT研究针对不同人群、用药时机及用药剂量及疗程、治疗机制，而且外周血NK细胞与dNK细胞的相关性及其机制仍需纳入大量研究来进一步探索。
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