毕节市不同地方引种油用牡丹根部丹皮酚,芍药苷含量测定*
时间：2023-06-19 11:55:04 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
汪青筑 黎代余 刘洪明
油用牡丹是毛茛科、芍药属植物，多年生落叶小灌木。油用牡丹具有较高结实率，主要是采收油用牡丹种子、提取油料为目的而种植的牡丹品种或资源类型[1]。具有植株高大、花色艳丽、抗旱耐寒、少病虫害、结实能力强等优良特性; 中国在实际生产中牡丹品种主要有凤丹和紫斑 2个品种[2,3]。油用牡丹是在药用牡丹(凤丹) 基础上发展起来的木本油料植物，定植后50年不换茬，堪称“铁杆庄稼”[4]。同时比其他品种牡丹具有更高的经济价值和景观生态价值，在改善生态环境、增加农民收益、对接精准扶贫政策等具有重要意义[5,6]。
毕节位于贵州省西北部，地处川、滇、黔3省结合部，北亚热带湿润季风气候，平均气温13.20 ℃，年降雨量1100 mm左右。气候及地理条件都非常适宜油用牡丹的生长[7]。目前，在毕节地区引种和推广的油用牡丹主要以“凤丹”品种为主。
本实验旨在研究油用牡丹的根部(牡丹皮)的成分含量测定，提高油用牡丹的利用范围和增加其经济价值。牡丹皮具有清热凉血，活血化瘀的功效。用于热入营血，温毒发斑，吐血衄血，夜热早凉，无汗骨蒸，经闭痛经，跌扑伤痛，痈肿疮毒[8]。牡丹皮中主要含有丹皮酚类和芍药苷类成分[9]。目前用于丹皮酚化学成分的测定方法主要有高效液相色谱法[10]、紫外分光光度法[11]、气相色谱法[12]、薄层扫描法[13]等。本实验主要采用高效液相色谱法对毕节市不同地方引种油用牡丹进行含量测定，该测定方法准确可靠，重复性好。
在此基础上选定黔西县杜鹃街道大兴社区、赫章县六曲河镇、威宁县白马村、毕节市杨家湾、金沙县茶园镇石钟村、百里杜鹃管理区、织金县官寨乡、大方县雨冲乡8个地方的引种牡丹进行丹皮酚和芍药苷的含量测定，对促进毕节实验区中药材产业发展，乡村振兴意义重大。
1.1 供试材料
1.1.1 牡丹药材采自黔西县杜鹃街道大兴社区、赫章县六曲河镇、威宁县白马村、毕节市杨家湾、金沙县茶园镇石钟村、百里杜鹃管理区、织金县官寨乡、大方县雨冲乡8个地方，经鉴定为毛茛科植物牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)的根及根皮。见表1。
表1 牡丹药材
1.1.2 仪器与设备赛默飞UItiMate 3000 XRS 型高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher公司)；
ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm，美国安捷伦公司)；
OHAUS CORPORTION 电子分析天平(十万分之一，美国OHAUS公司)；
超声机(上海冠特超声仪有限公司)
1.1.3 试剂丹皮酚对照品(批号：110708-201407，中国食品药品检定研究所)；
芍药苷对照品(批号：110736-201842，中国食品药品检定研究所)；
乙腈(色谱纯，美国Thermo Fisher公司)；
甲醇(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)；
水为蒸馏水；
其他试剂均为分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 丹皮酚含量测定溶液制备：对照品溶液制备 取丹皮酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含20 μg的溶液，即制得浓度为67.8 μg/ml对照品溶液，保存于4 ℃冰箱中备用。供试样品溶液制备：将收集到的不同产地油用牡丹根皮样品烘干至质量恒定，制粉。取粗粉约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，密塞，称定重量，超声处理(功率300 W，频率50 kHz) 30 min，冷却，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1 ml，置25 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀后过 0.45 μm 的滤膜，滤液为供试样品溶液，保存于4 ℃冰箱中备用。
标准曲线的绘制:精密量取丹皮酚标准 5 ml、10 ml、15 ml、20 ml和25 ml溶液，并分别置于10.0 ml的容量瓶中，采用甲醇定容，上机检测。色谱条件：色谱柱为ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；
流动相：甲醇(A)-水(B)(45∶55；
柱温：25 ℃；
流速 1.0 ml/min)；
检测波长：274 nm；
出峰时间：4 min；
进样量：10 μl；
理论板数按丹皮酚峰计算应不低于5000。在这一条件下，油用牡丹根皮样品的液相色谱基线平稳，色谱峰数较多，峰形较好，其中主要成分丹皮酚分离度到规定要求。见图1。以标准品含量(C)为横坐标，峰面积积分值(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得到丹皮酚的线性回归方程和线性范围。见图2。
图1 丹皮酚标准曲线图
图2 芍药苷标准品曲线
精密度、稳定性、重复性实验:①精密度。精确吸取丹皮酚标准溶液10 μl注入高效液相色谱仪测定其峰面积，重复5次，按照“丹皮酚标准曲线的绘制”项下色谱条件进样测定；
②稳定性。按照“丹皮酚溶液制备”项下操作制备溶液，精确吸取丹皮酚标准溶液，分别于室温放置0、2、4、6、8、12 h测定按照“丹皮酚标准曲线的绘制”项下测定其峰面积，进样量10 μl，重复5次；
③重复性。取同一批样品依法制备6分供试品溶液按照“丹皮酚标准曲线的绘制”项下测定峰面积，进样量10 μl，重复5次；
计算RSD以评价实验的精密度(1.64%)、稳定性(2.68%)、重复性(2.41%)，结果表明仪器设备精密度良好，供试样品在12 h内稳定性好，重复性良好。
加样回收实验:精密称取已知丹皮酚含量的丹皮酚样品5份各0.05 g，再分别精密加入丹皮酚标准品15 ml，按照“丹皮酚溶液制备”项下操作制备溶液后再按照“丹皮酚标准曲线的绘制”项下测定峰面积，进样量10 μl，计算回收率为99.34%和RSD=2.34%，结果表明该方法的回收率良好。
样品测定:精密称取不同产地油用牡丹样品 0.5 g，按照“丹皮酚溶液制备”项下操作制备溶液，分别精密吸取样品溶液各平行3组10 μl注入液相色谱仪测定峰面积，计算不同产地牡丹药材的丹皮酚含量。见表2。
1.2.2 芍药苷含量测定溶液制备:对照品贮备液 取经五氧化二磷减压干燥器中干燥36 h的芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，即制得浓度为65.4 μg/ml对照品溶液，保存在 4 ℃ 冰箱中备用。供试样品溶液:将收集到的不同产地油用牡丹根皮样品烘干至质量恒定，制粉。取粗粉约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，称定重量，浸泡4 h，超声处理(功率300 W，频率50 kHz)20 min，冷却，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀后过0.45 μm的滤膜，滤液为供试样品溶液，保存在4 ℃冰箱中备用。
标准曲线的绘制:精密量取芍药苷标准溶液2 ml、4 ml、6 ml、8 ml和10 ml分别置于25 ml容量瓶中，用甲醇定容，上机检测。色谱条件：色谱柱为ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；
流动相：水(B)-乙腈(C)(86∶14；
柱温：25 ℃；
流速1.0 ml/min)；
检测波长：250 nm；
出峰时间：15 min；
进样量：10 μl；
理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000。在这一条件下，油用牡丹根皮样品的液相色谱基线平稳，色谱峰数较多，峰形较好，其中主要成分芍药苷分离度达到规定要求。见图3。以标准品含量(C)为横坐标，峰面积积分值(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得到芍药苷的线性回归方程和线性范围，结果表明，线性关系良好。见图4。
精密度、稳定性、重复性试验：①精密度。精确吸取芍药苷标准溶液10 μl注入高效液相色谱仪测定其峰面积，重复5次，按照“芍药苷标准曲线的绘制”项下色谱条件进样测定；
②稳定性。按照“芍药苷的溶液制备”项下操作制备溶液，精确吸取芍药苷标准溶液，分别于室温放置0、2、4、6、8、12 h按照“芍药苷标准曲线的绘制”项下测定其峰面积，进样量10 μl，重复5次；
③重复性。取同一批样品依法制备6份供试品溶液“芍药苷标准曲线的绘制”项下测定峰面积，进样量10 μl，重复5次。计算RSD以评价试验的精密度(1.89%)、稳定性(2.34%)、重复性(2.67%)，结果表明仪器设备精密度良好，供试样品在12 h内稳定性好，重复性良好。
加样回收试验：精密称取已知芍药苷含量的芍药苷样品5份各0.05 g，再分别精密加入芍药苷标准品15 ml，按照“芍药苷的溶液制备”项下操作制备溶液后再按照“芍药苷标准曲线的绘制”项下测定测定峰面积，进样量10 μl，计算回收率(100.34%)和RSD(2.41%)，结果表明该方法的回收率良好。
样品测定：精密称取牡丹样品0.1 g，按照“芍药苷的溶液制备”项下操作制备溶液，分别精密吸取样品溶液各平行3组10 μl注入液相色谱仪测定峰面积，计算不同产地牡丹药材的芍药苷含量。见表2。
表2 不同产地牡丹药材含量测定结果
2.1 丹皮酚和芍药苷的标准曲线随着丹皮酚含量(C)升高，峰面积(A)呈上升趋势，二者存在线性关系，其直线回归方程为：y=83.305x+0.9781(R2=0.9996)。表明丹皮酚含量在 0.339～1.695 μg与峰面积有良好的线性关系。见图1。随着芍药苷含量(C)升高，峰面积(A)呈上升趋势，二者存在线性关系，其直线回归方程为：y=19.127x+0.0096(R2=1)。表明芍药苷含量在 0.1308～0.654 μg与峰面积有良好的线性关系。
2.2 丹皮酚和芍药苷的含量丹皮酚：精密度、稳定性、重复性实验丹皮酚样品溶液的RSD分别为1.64%、2.68%、2.41%，结果表明仪器设备精密度良好，供式样品在12 h内稳定性好，重复性良好；
加样回收率(99.34%)和RSD(2.34%)，结果表明该方法的回收率良好。从表2 可见：不同产地油用牡丹根部丹皮酚的含量：黔西县杜鹃街道大兴社区1.84%、赫章县六曲河镇2.15%、威宁县白马村2.22%、毕节市杨家湾1.49%、金沙县茶园镇石钟村1.57%、百里杜鹃管理区1.71%、织金县官寨乡2.12%、大方县雨冲乡2.68%；
不同引种地油用牡丹丹皮酚的含量依次：大方县雨冲乡>威宁县白马村>赫章县六曲河镇>织金县官寨乡>黔西县杜鹃街道大兴社区>百里杜鹃管理区>金沙县茶园镇石钟村>毕节市杨家湾；
丹皮酚的含量最高的是大方县雨冲乡，其次是威宁县白马村，再次是赫章县六曲河镇。从图3看出，牡丹药材与丹皮酚标准品在相同的保留时间下有相同的峰值出现。
图3 丹皮酚标准品和牡丹药材的HPLC图
芍药苷：精密度、稳定性、重复性实验芍药苷样品溶液的RSD分别为1.89%、2.34%、2.67%。结果表面仪器设备精密良好，供试样品在12 h内稳定性好，重复性良好；
加样回收率(100.34%)和RSD(2.41%)，结果表明该方法的回收率良好。从表2 可见：不同产地油用牡丹根部芍药苷的含量：黔西县杜鹃街道大兴社区1.47%、赫章县六曲河镇1.52%、威宁县白马村1.23%、毕节市杨家湾2.68%、金沙县茶园镇石钟村1.69%、百里杜鹃管理区1.93%、织金县官寨乡1.94%、大方县雨冲乡2.29%；
不同引种地油用牡丹芍药苷的含量依次：毕节市杨家湾>大方县雨冲乡>织金县官寨乡>百里杜鹃管理区>金沙县茶园镇石钟村>赫章县六曲河镇>黔西县杜鹃街道大兴社区>威宁县白马村；
芍药苷的含量最高的是毕节市杨家湾，其次是大方县雨冲乡，再次是织金县官寨乡。
从图4可知，牡丹药材与丹皮酚标准品在相同的保留时间下有相同的峰值出现。
图4 芍药苷标准品和牡丹药材的HPLC图
目前，对油用牡丹的研究主要集中在栽培技术、产油情况以及其油质研究方面，对其药材质量控制和药材鉴别相对研究较少。本实验采用高效液相色谱法对毕节市不同引种地油用牡丹药材质量含量测定。高效液相色谱法具有重现性好、分离效能高、分析速度快等优点，成为药材与中药制剂质量控制、有效成分及其含量检测中应用最广泛的指纹图谱建立方法[14]。
本研究表明，以丹皮酚为指标，流动相：甲醇(A)-水(B)(45∶55/V∶V；
柱温：25 ℃；
流速1.0 ml/min)的条件下；
油用牡丹药材质量最好的是大方县雨冲乡，其次是威宁县白马村，再次是赫章县六曲河镇；
以芍药苷为指标，在流动相：水(B)-乙腈(C)(86∶14；
柱温：25 ℃；
流速1.0 ml/min)的条件下，油用牡丹药材质量最好的是毕节市杨家湾，其次是大方县雨冲乡，再次是织金县官寨乡。最终针对油用牡丹根皮中的丹皮酚和芍药苷2种有效成分综合分析下来毕节市大方县雨冲乡引种栽培的油用牡丹药材质量最好。
本实验采集的油用牡丹样品覆盖毕节市管辖的范围，样品收集覆盖范围较为全面，最终实验结果能代表本辖区油用牡丹药材的质量；
可为油用牡丹样品质量控制提供方法支撑，为毕节市油用牡丹引种与质量控制提供科学依据。同时，本实验尚未对油用牡丹根皮中丹皮酚和芍药苷以外的其他有效成分进行质量分析测定，下一步将进行深入研究，以得出更为全面的实验结果，检测方法可为贵州省27个产业链之中药材产业链的发展，为毕节实验区中药材产业结构调整、药材种植和发展提供参考依据。
