长链非编码RNA,Linc8910对胶质瘤干细胞增殖和自我更新的影响
时间：2023-06-16 16:00:05 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
蔡岩，肖大可，潘欣，满江红
国家生物医学分析中心，北京 100850
胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是人脑最常见、最致命的原发性肿瘤。脑胶质瘤患者平均生存周期仅为12～15个月[1-2]。胶质瘤干细胞（glioma stem cell，GSC）是位于脑胶质瘤细胞顶层的具有自我更新、多向分化及增殖潜能的一类肿瘤细胞[3-5]，它们能够起始肿瘤发生并且对放化疗不敏感。越来越多的证据表明脑胶质瘤干细胞是脑胶质瘤生长、转移与复发的决定性因素[6-7]。
人类基因组中大部分RNA不能被翻译为蛋白质，这类RNA被称为非编码RNA[8]。一部分非编码RNA的长度大于200个核苷酸，被称为长链非编码 RNA（long non-coding RNA，LncRNA）。其中，基因间长链非编码RNA（long intergenic non-coding RNA，LincRNA）是一类处于编码基因之间的非编码RNA，通常小于蛋白质编码的转录本。LincRNA的表达量低，但却表现出较强的组织特异性[9-11]。部分研究表明LincRNA在表观遗传、细胞周期及分化等生命活动中发挥重要的调控作用。在脑胶质瘤中，LincRNA的异常表达影响着肿瘤细胞的生长与分化，对脑肿瘤发生发展起重要作用[12-15]。然而，LincRNA在胶质瘤干细胞中的功能有待进一步研究。
本实验室前期通过RNA测序筛选，比对了多株不同脑胶质瘤患者来源的GSC以及对应的非干性肿瘤细胞中LncRNA的表达，筛选出一系列在GSC中特异性高表达且发挥重要功能的LncRNA。通过TCGA数据库对筛选到的LncRNA进行临床相关性分析，我们发现Linc8910具有良好的预后相关性。本研究通过短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）干涉技术在GSC中敲低Linc8910，检测其对GSC的增殖能力及自我更新能力的影响。进一步探究了Linc8910在胶质瘤干细胞生长增殖中的功能，从LncRNA角度为脑胶质瘤的治疗提供新靶点。
1.1 细胞
人胚胎肾细胞HEK293T来自中国科学院上海细胞库；
人源GSC细胞T4121受赠于美国加州大学Jeremy Rich实验室，该细胞株按照本实验室方案进行了筛选及鉴定。
DMEM培养基、Trypsin-EDTA、谷氨酰胺（100×）、青霉素-链霉素混合液（100×）、丙酮酸钠（100 mmol/L）、磷酸钙转染试剂MaxiCaP购自中科迈晨（北京）科技有限公司；
胎牛血清购自Ex-Cell Bio生物科技有限公司；
PowerUp SYBR Green Master Mix、Neuro-basal培养基、B-27血清替代物购自Thermo Fisher公司；
Accutase购自Sigma公司；
碱性成纤维细胞生长因子（β-FGF）、重组人表皮生长因子（rhEGF）购自R&D Systems公司；
PrimeScript RT Master Mix购自TaKaRa公司；
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay购自Promega公司；
RNA提取试剂盒RNeasy Mini Kit购自Qiagen公司。
Q-PCR仪（LC96）购自 Roche公司；
PCR仪（GSX1）、CO2恒温细胞培养箱（FORMA3111）、荧光成像显微镜（EVOSM5000）购自Thermo Fisher Scientific公司；
Glomax全自动荧光检测仪（9101-002）购自Promega公司；
微量分光仪（NanoDrop 2000c）购自基因有限公司。
1.2 培养基的配制
在无菌超净台中配制培养基。
1.2.1 DMEM完全培养基 向500 mL DMEM培养基中加入50 mL胎牛血清和5.5 mL青霉素-链霉素混合液，充分混匀后放置4℃冰箱保存。
1.2.2 干细胞完全培养基 向500 mL Neurobasal培养基中加入青霉素-链霉素混合液、丙酮酸钠和左旋谷氨酰胺各5 mL，加入10 mL B-27血清替代物以及浓度均为20 ng/mL的rhEGF和β-FGF各20 μL，充分混匀后4℃保存。
1.3 细胞培养及传代
1.3.1 HEK293T的培养与传代 用DMEM完全培养基于37℃、5% CO2条件下恒温培养。细胞密度过高会影响细胞生长，因此当细胞密度大于85%时须进行传代培养。具体步骤为：弃去培养皿中的培养基；
沿培养皿内壁加入无菌PBS，轻轻摇晃培养皿洗净细胞代谢物和残余培养基，弃去PBS；
向培养皿中加入1 mL Trypsin-EDTA，于37℃培养箱静置1 min进行消化；
向培养皿中加入3 mL DMEM完全培养基终止消化，将细胞悬液转移至离心管中，800 r/min离心3 min，弃上清；
用DMEM完全培养基重悬细胞后接种在新的培养皿中，于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养。
1.3.2 GSC的培养与传代 用干细胞完全培养基于37℃、5% CO2条件下恒温培养。GSC在培养过程中会聚集形成肿瘤细胞球，肿瘤细胞球较大时会影响细胞增殖和生长状态，因此须消化传代。具体步骤为：将培养皿中的全部细胞悬液转移至离心管中，800 r/min离心3 min，弃上清；
用无菌PBS重悬细胞并反复吹洗，800 r/min离心3 min，弃上清；
用1 mL Accutase胰酶重悬细胞，消化3 min；
加入5 mL无菌PBS稀释胰酶和细胞的混悬液，800 r/min离心3 min，弃上清；
用干细胞完全培养基重悬细胞，转移至新的培养皿中，于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养。
1.4 血清诱导GSC分化
将GSC消化成单个细胞后，离心去上清，用DMEM完全培养基重悬细胞，充分混匀后接种于培养皿中。由于DMEM完全培养基中含有10%的胎牛血清，可以诱导GSC向非干性肿瘤细胞（non-stem tumor cell，NSTC）分化。GSC完全分化为NSTC的评价标准为SOX2和Olig2蛋白（GSC相关蛋白标志物）逐渐减少至消失，同时胶质纤维酸性蛋白（GFAP，NSTC蛋白标志物）表达明显增加，在细胞形态上可以看到细胞处于贴壁状态，无法形成肿瘤球。按照此方法分化GSC，约7 d分化为NSTC。
1.5 慢病毒包装及感染细胞
将3×106HEK293T细胞接种于10 cm培养皿中，待细胞密度长至30%～40%时采用磷酸钙转染试剂盒进行病毒包装。向1.5 mL EP管中加入包装质粒psPAX2和pCMV-VSVG各5 μg，目的质粒（pLKO-shNT、pLKO-sh8910#1、pLKO-sh8910#2和pLKO-sh8910#3）各 5 μg，用 1 mL HBS 混匀，静置5 min；
滴入 70 μL CaCl2溶液，混匀后静置 15 min；
将转染体系滴加到提前接种的HEK293T细胞中，轻轻摇晃培养皿使液体混匀，于37℃，5% CO2培养箱中继续培养，6 h后更换成新鲜的DMEM完全培养基，72 h后将培养基上清收集至50 mL离心管中，3500 r/min离心15 min，用0.45 μm孔径的滤器过滤到新的离心管中，向过滤后的病毒液体中加入病毒浓缩液（5×PEG），颠倒混匀，4℃静置过夜；
将病毒液体于4℃、7000 r/min离心15 min，吸去上清，用1 mL冰PBS重悬病毒沉淀，混匀后转移至1.5 mL EP管中，12 000 r/min离心15 min，取上清分装到600 μL无菌EP管中，每管分装200 μL，-80℃保存。
将GSC消化处理成单个细胞，取1.5×106GSC用干细胞培养基重悬，接种于10 cm培养皿中，加入200 μL病毒后充分混匀，置于37℃、5% CO2培养箱中，每2 d传代一次。
1.6 在mRNA水平检测Linc8910的表达
收取1×106分化前的GSC及分化后的NSTC，用RNeasy Mini Kit提取RNA。加入350 μL Buffer RLT重悬细胞并充分裂解；
加入350 mL无RNA酶的70%乙醇混匀，立即转入结合柱；
室温静置2 min，10 000 r/min离心30 s，弃下层液体；
向结合柱中加入 700 μL RW Wash Buffer，4℃、10 000 r/min离心30 s，弃下层液体；
加入500 μL RPE Buffer，4℃、10 000 r/min离心30 s，弃下层液体，重复此步骤2次；
将结合柱放入新的无RNA酶的EP管中，每管加入40 μL无RNA酶水，静置2 min；
室温10 000 r/min离心2 min洗脱，用NanoDrop 2000c测量浓度。
将提取的RNA进行逆转录。向PCR管中加入 2 μL 提取的 RNA 样品和 2 μL 5×PrimeScript RT Master Mix，最后加入6 μL无RNA酶水补齐总体系至10 μL，在PCR仪中进行逆转录，程序为37℃ 15 min、85℃ 15 s。在Q-PCR引物设计相关网站（Primer Bank）查找适合Linc8910的QPCR引物，由北京博迈德基因科技有限公司合成。10 μL Q-PCR反应体系包括逆转录的Linc8910的cDNA模板3 μL、上游和下游引物各0.25 μL、SYBR Green Master Mix 5 μL、ddH2O 1.5 μL。将体系加到96孔板中，于Q-PCR仪中按设定程序进行扩增。
1.7 细胞活力测定及肿瘤细胞球形成能力
将感染病毒后的GSC消化处理成单个细胞，台盼蓝染色计算活细胞数目。将敲低组和对照组分别接种到96孔板，每孔2×103细胞，每组3个复孔，采用CellTiter-Glo试剂盒分别检测第0、2、4 d的细胞活力。每孔加入100 μL CellTiter-Glo试剂，混匀后取200 μL加到可避光的黑色96孔板中，水平摇床孵育10 min，用Glomax全自动荧光仪检测细胞活力。观察第6 d孔板里的肿瘤球数目和形态，用成像显微镜拍摄。
1.8 数据来源与分析
Linc8910信息源自UCSC Genome Browser数据库（http://genome.ucsc.edu/）。所有数据分析均使用GraphPad Prism 8.02软件。将T4121 GSC分化前后以及敲低Linc8910后检测得到的mRNA水平数据按分组整理，填入GraphPad Prism 8.02软件的表格中绘制生成图表，图3A组间差异分析采用t检验。
2.1 Linc8910基本信息
UCSC Genome Browser数据库调研分析表明，Linc8910的名称为PCOLCE-AS1，位于第7号染色体上，全长2550 bp（图1）。
图1 Linc8910基本信息（UCSC Genome Browser数据库）
2.2 Linc8910在GSC中特异性高表达
选取T4121 GSC及其分化第6 d的NSTC，分别收取细胞样品，裂解后提取RNA。用2对不同的引物（Primer1和Primer2）对Linc8910的表达进行Q-PCR验证，用干细胞标志蛋白Olig2和Sox2的表达水平指示GSC分化情况。结果显示，GSC在血清诱导分化第6 d时其干细胞标志物的表达明显降低，表明GSC分化。Linc8910在T4121 GSC中的mRNA水平明显高于其分化后的NSTC（图2）。以上结果表明Linc8910在T4121 GSC中高表达，而在T4121 NSTC中低表达。
图2 Linc8910在T4121 GSC和分化后的NSTC中的mRNA表达水平（x±s，n=3）
2.3 敲低Linc8910对GSC生长的影响
为了敲低Linc8910在细胞内的表达，我们构建了靶向Linc8910不同序列的shRNA干涉质粒sh8910#1、sh8910#2、sh8910#3及对照干涉质粒shNT，并进行慢病毒包装。慢病毒感染T4121 GSC后72 h收取细胞样品，提取RNA后进行QPCR分析，对Linc8910的敲低效果进行检测（图3A）。同时，我们将感染病毒后的GSC消化成单个细胞，将敲低组和对照组细胞分别接种96孔板，用Cell Titer-Glo试剂盒测定第0、2、4 d的细胞活力（图3B）。此外，我们将病毒感染后的GSC接种于96孔板，观察细胞形成肿瘤球的情况，并用成像显微镜拍摄GSC形成肿瘤球的形态（图3C）。实验结果表明，靶向Linc8910的3条不同的shRNA干涉序列均具有良好的敲低效果。细胞活力测定结果显示Linc8910敲低组的细胞活力明显低于对照组，表明敲低Linc8910能够明显抑制GSC的增殖能力。肿瘤球形成实验结果显示，Linc8910敲低组的肿瘤细胞球数量明显少于对照组，表明敲低Linc8910能够显著抑制GSC的自我更新能力。
脑胶质瘤是人类中枢神经系统常见的肿瘤，它的发生发展与多种因素密切相关。胶质母细胞瘤是脑肿瘤中恶性程度最高的原发性实体瘤。GBM具有较强的浸润性，与正常脑组织无明显边界，导致难以完全切除[16-17]。目前，临床上主要的治疗手段为手术切除联合药物治疗及放射治疗等，但治疗效果不理想。研究表明，GSC在GBM的发生、维持、转移与复发过程中均发挥着关键性作用[18-19]。因此，将GSC作为研究对象并探究其调控机制，对GBM的发生和治疗具有重要意义。
目前，对于LncRNA在GSC中的功能研究较少。部分研究表明，脑胶质瘤中LncRNA的异常表达可能影响GSC的生长与分化，对脑肿瘤发生有重要影响[13,20]。基于本实验室的GSC研究体系，我们从LncRNA角度探究其对GSC的调控机制。我们通过RNA测序筛选技术鉴定到Linc8910在GSC中特异性高表达，且表达水平显著高于其对应的NSTC。为了了解Linc8910在GSC中的功能，通过shRNA干涉技术在GSC中敲低Linc8910，发现敲低Linc8910表达能够显著抑制GSC的肿瘤细胞球形成能力及细胞活力，提示Linc8910对GSC的增殖及脑胶质瘤的发生发展可能具有重要的调控功能。我们将进一步探究Linc8910在GSC中的作用机制，为肿瘤治疗提供新的靶点和策略。
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