骆驼刺酸性多糖对小鼠脾脏淋巴细胞免疫增强作用的研究

特列克·阿依恒别克,赛福丁·阿不拉,萨比热·热夏提, 况玲,德力拜尔·木拉提,阿得力江·吾斯曼*

(1.新疆农业大学动物医学学院,新疆 乌鲁木齐 830052;2.新疆维吾尔自治区动物疫病预防控制中心,新疆 乌鲁木齐 830011)

骆驼刺(AlhagisparsifoliaShap)为豆科蝶形花亚科骆驼刺属的多年生半灌木[1]。我国骆驼刺主要分布于西北地区的平原荒漠和半荒漠地带,尤其在新疆,分布面积达1.73×104km2[1-2]。骆驼刺含有大量的多糖类、黄酮类、生物碱类、蛋白质类化合物[2]。骆驼刺糖性热而燥,能够滋补强壮,具有涩肠止痛的功效[3]。有关骆驼刺药理作用的研究主要集中在骆驼刺分泌的糖分小颗粒刺糖中,研究显示刺糖多糖具有良好的免疫增强作用,能够诱导机体产生有效的体液免疫及细胞免疫应答,是一种良好的免疫增强剂[4-5]。近几年来,由于骆驼刺生长地降雨量的增加，导致秋收时大量刺糖被雨水溶解渗入土中,使得刺糖产量下降,价格上涨,影响其作为廉价免疫增强剂在畜禽养殖业中的推广。

多糖作为天然高分子化合物分子结构复杂,多糖结构的复杂性决定了多糖功能的多样性。多糖有增殖免疫、抗病毒、抗炎、抗肿瘤等多种生物学活性[6-7]。多糖通常分为中性多糖、酸性多糖和碱性多糖,其中酸性多糖除了含中性多糖的官能团外,还常含有糖醛酸、硫酸根等基团,可增强其生物活性,存在重大的研究和应用价值[8]。因此,寻求植物中具有良好免疫增强作用的多糖成分,研究其免疫增强活性,是将其作为免疫增强剂应用及推广的关键。

目前,对骆驼刺多糖(AlhagisparsifoliaShap polysaccharide,ASP)的研究报道较多,但对骆驼刺中多糖成分的分离、鉴定及免疫增强活性作用的研究鲜有报道。本试验采用水提醇沉法及柱层析法,分离出骆驼刺中酸性多糖(acidic ASP,aASP)成分,对其进行鉴定,用MTT法、流式细胞法和ELISA等方法检测aASP对小鼠脾脏淋巴细胞的增殖、T细胞分化及细胞因子表达等作用的影响,旨在检测aASP的免疫增强作用并阐明其作用机制,为研究其增殖免疫活性及新型免疫增强剂的开发利用奠定基础。

1.1 试验材料及试验动物

RPMI-1640细胞培养基、PBS、红细胞裂解液、脂多糖(LPS)溶液、植物血凝素(PHA)和四甲基偶氮唑蓝(MTT)溶液购自北京索莱宝科技有限公司;胎牛血清、双抗购自北京沃比森科技有限公司;分析纯二甲基亚砜(DMSO)购自天津市金铂特化工有限公司;IL-4、IL-6、TNF-α和IFN-γ检测试剂盒购自上海凡科维生物科技有限公司;Galaxy 48 R CO2细胞培养箱购自英国New Brunswick公司;TE2000-W倒置显微镜购自Nikon公司。Balb/c小鼠:4～6周龄,全雌,购自新疆医科大学,试验前适应性饲养1周。

1.2 骆驼刺酸性多糖(aASP)的提取、分离及纯化

称取干燥骆驼刺1 000 g,粉碎过60目筛,按1∶3的体积比分别经过石油醚及95%乙醇回流,用于脱脂及去除醇溶性小分子,再按1∶9的体积比用去离子水提取粗多糖(80 ℃,3 h),减压浓缩至1 g·mL-1。按80%体积进行醇沉,得到的粗多糖用Sevage试剂,3次重复脱蛋白。将去蛋白后的多糖经过透析袋透析后去除小分子单糖及寡糖,采用大孔树脂AB-8进行脱色。将脱色后的粗多糖经过DEAE-52柱(2.6 cm×50 cm,流速为1 mL·min-1)进行分离[9],收集洗脱液,经苯酚硫酸法检测洗脱吸光值(A490),绘制洗脱线,再经过Sephadex G-100(2.6 cm×70 cm,流速0.5 mL·min-1)进行纯化,得到高纯度的aASP。制备1 mg·mL-1的aASP,用含胎牛血清的RPMI-1640培养液稀释至所需浓度备用。

1.3 aASP含量的测定

苯酚硫酸法建立多糖标准曲线:配制1 mg·mL-1葡萄糖标准液,吸取0、0.2、0.4、0.6和0.8 mL葡萄糖标准液,以蒸馏水补至2 mL,各试管加入5%苯酚和浓硫酸,紫外可见光谱490 nm处检测aASP的糖含量[10]。硫酸-咔唑法建立标准曲线:配制40 μg·mL-1葡萄糖醛酸标准液,分别取0.1、0.25、0.50、0.75和 1 mL 标准工作液于试管中,补水至1 mL,每孔加入125 μL硼酸液,紫外可见光谱530 nm处检测aASP的糖醛酸含量[11]。BCA微孔酶标仪法:按50∶1体积比配制BCA工作液,取10 μL BCA标准品用PBS稀释至100 μL,使终浓度为0.5 mg·mL-1,作为标准品溶液,分别将标准品溶液按照0、2、4、6、8、12、16和20 μL加到96孔板的蛋白标准瓶中,加PBS补足至20 μL,各孔加入200 μL BCA工作液,常温放置15～30 min,在562 nm处测定aASP中的蛋白含量[12]。

1.4 aASP的红外光谱测定

按照KBr压片法的制备[13]流程,将aASP置于常压干燥器中过夜,将干燥的aASP按1∶100的质量比与KBr粉末混合,研磨压片,用红外光谱仪进行扫描,记录吸收峰。

1.5 aASP对小鼠脾淋巴细胞毒性作用的测定

制备脾脏淋巴细胞。使用颈椎脱臼法处死小鼠,无菌分离脾脏后进行研磨、匀浆,加入红细胞裂解液,去除红细胞后收集脾脏淋巴细胞,PBS洗涤3～5次,用RPMI-1640培养液调整细胞含量至1×106mL-1,接种96孔细胞培养板后培养[14]。将1 000 μg·mL-1aASP用细胞维持液倍比稀释成7个浓度梯度,每孔加入100 μL,每个浓度重复4孔。同时设细胞对照组(仅加细胞培养液)。培养45 h后用MTT法经酶联免疫检测仪检测吸光值(A570)。选择A570值不小于细胞对照组的最大浓度作为该多糖的最大安全浓度。

1.6 aASP对小鼠脾淋巴细胞增殖影响的测定

按照1.5节方法制备小鼠脾脏淋巴细胞悬液,将混合均匀的细胞悬液转入96孔板,每孔80 μL,然后分别加入20 μL多糖,多糖浓度分别为500、125 和31.25 μg·mL-1,3种浓度梯度多糖协同LPS组(LPS终质量浓度5 μg·mL-1)刺激B淋巴细胞增殖,3种浓度梯度多糖协同PHA组(PHA终质量浓度5 μg·mL-1)刺激T淋巴细胞增殖,RPMI-1640细胞培养液作为空白对照组,置于37 ℃、5% CO2培养箱里培养44 h后,每孔加入30 μL MTT,4 h后弃上清液,每孔加入100 μL DMSO,振荡培养5 min,检测A570值,作为细胞增殖指标。

1.7 aASP对小鼠脾脏T细胞免疫分型影响的测定

淋巴细胞制备方法同1.5节,用RPMI-1640细胞培养液调整细胞含量至1×106mL-1,于24孔细胞培养板中培养,分别加入500、125和31.25 μg·mL-1aASP溶液100 μL,同时设阳性对照(LPS)组和空白对照组(RPMI-1640细胞培养液),于细胞培养箱中以适当的条件培养48 h后,收集细胞并以PBS洗涤2次,再用PE-Cyanine5-CD3e、FITC-CD4和PE-CD8a荧光抗体标记淋巴细胞,孵育30 min后用PBS洗涤2次,流式细胞仪检测T细胞分化情况。

1.8 aASP对小鼠脾淋巴细胞因子分泌影响的检测

收集1.5节中药物处理48 h的细胞上清液,2 000 r·min-1室温离心5 min,去除沉淀,按照ELISA试剂盒说明书操作,经酶标仪测定A570值,检测细胞上清液中细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-4的含量。

1.9 统计分析

图1 骆驼刺酸性多糖(aASP)的DEAE-52(A)和Sephadex G-100(B)洗脱曲线Fig.1 Elution curves of DEAE-52(A)and Sephadex G-100(B)for acidic Alhagi sparsifolia Shap polysaccharide(aASP)

2.1 aASP分离纯化后的含量

图1-A为多糖经过凝胶纤维DEAE-52分离后的洗脱曲线,多糖分别经去离子水和0.1及0.2 mol·L-1的NaCl溶液洗涤后分别出现3个收集峰,其中多糖经去离子水洗脱后在第9～21管出现的收集峰面积最大,为主要收集峰。为了得到糖含量更高的纯多糖,对DEAE-52分离后的第1个吸收峰用Sephadex G-100柱进一步纯化,如图1-B洗脱曲线所示。aASP的洗脱曲线有2个峰,其中第1个峰面积最大、峰值最高且对称性较好,可知纯化后的多糖aASP为均质多糖。采用苯酚硫酸法测定纯化后aASP的糖含量,得到回归方程y=17.71x-0.005 9(R2=0.999 5);用硫酸-咔唑法测定样品中糖醛酸的含量,得到线性回归方程y=11.515x-0.005 9(R2=0.999 8);采用BCA试剂盒进行蛋白含量的测定,得到线性回归方程y=0.008 2x-0.002 39(R2=0.999)。骆驼刺多糖提取物糖含量为(81.8±1.2)%,糖醛酸含量为(17.34±0.75)%,蛋白含量为(0.54±0.08)%,可初步判断为酸性多糖。

2.2 aASP的红外光谱

如图2所示:aASP在3 430.29 cm-1处有较宽的伸缩峰,在2 936.76 cm-1处有中强吸收峰,以上2个吸收峰为典型糖类特有的峰。在1 746.88 cm-1处特征峰有个酯基,在1 617.69 cm-1处的强吸收峰为羧基和羰基不对称伸缩震动吸收峰。在1 640～1 610 cm-1处有特征峰表明有糖醛酸,在1 420.14 cm-1测得羟基的吸收峰,1 300～1 000 cm-1的吸收峰为多糖C—O和C—C键的伸缩震动吸收峰。结合含量测定结果进一步确定为酸性多糖。

2.3 aASP对小鼠脾淋巴细胞的最大安全浓度

如图3所示:aASP质量浓度为1 000 μg·mL-1时A570值与细胞对照组无显著差异(P>0.05),而aASP浓度在500～125 μg·mL-1时A570值显著高于细胞对照组(P<0.05)。结果表明,aASP在1 000 μg·mL-1时无细胞毒性作用,表现出良好的安全性,而aASP浓度在500～125 μg·mL-1时对脾脏淋巴细胞产生细胞增殖作用。故将1 000 μg·mL-1作为aASP的最大安全浓度。

图2 aASP的红外光谱图Fig.2 Infrared spectrum of aASP

图3 aASP对脾脏淋巴细胞安全浓度的检测Fig.3 Safe concentration of aASP in spleen lymphocytes不同小写字母表示差异显著(P<0.05),下同。The different letters mean significant difference at 0.05 level. The same below.

图4 aASP单独(A)和aASP协同LPS(B)或PHA(C)刺激淋巴细胞增殖的变化Fig.4 Changes of lymphocyte proliferation stimulated by aASP alone(A)and with LPS(B)or PHA(C)aASPH、aASPM、aASPL表示aASP质量浓度分别为500、125、31.25 μg·mL-1 aASPH,aASPM and aASPL mean the mass concentration of aASP is 500,125 and 31.25 μg·mL-1,respectively;Con:空白对照Control;LPS:5 μg·mL-1 LPS;PHA:5 μg·mL-1 PHA μg·mL-1. 下同。The same below.

2.4 aASP对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

为了检测aASP对小鼠脾淋巴细胞的增殖效果,采用MTT法检测aASP刺激脾淋巴细胞后的A570值。如图4-A 所示:aASP 500 μg·mL-1的A570值显著高于空白对照组(P<0.05),而125和31.25 μg·mL-1aASP的A570值和空白对照组间无显著性差异(P>0.05),表明500 μg·mL-1aASP能显著促进脾淋巴细胞增殖。已知LPS能够诱导B淋巴细胞增殖,而PHA能够诱导T淋巴细胞增殖,因此将多糖和LPS或PHA混合作用于脾淋巴细胞可检测多糖协同LPS或PHA对B淋巴细胞或T淋巴细胞增殖的作用[15]。如图4-B、C所示:不同浓度aASP协同LPS或PHA产生的细胞增殖效果均显著高于单独的LPS组或PHA组(P<0.05),表明aASP不但能够单独刺激脾脏淋巴细胞的增殖,而且还能协同PHA对小鼠脾脏T淋巴细胞产生增殖效果,协同LPS对小鼠脾脏B淋巴细胞产生增殖效果。

2.5 aASP对小鼠脾T 淋巴细胞分型的影响

已知LPS能够同时促进T淋巴细胞CD4+和CD8a+的分化,因此LPS常作为阳性对照用于检测药物对CD4+和CD8a+T细胞的分化效果[15]。如图5-D、E所示:aASP能够促进CD4+和CD8a+T细胞的分化,分化水平均显著高于对照组(P<0.05)。高浓度aASP刺激CD4+T细胞分化的水平与LPS组相比无显著性差异(P>0.05);高、中浓度的aASP刺激CD8a+T细胞分化的水平与LPS组相比无显著性差异(P>0.05),以上结果表明高浓度aASP能够显著促进CD4+和CD8+T细胞的分化;如图5 F所示:高、中浓度aASP刺激CD4+/CD8a+T细胞的比值和LPS组相比无显著性差异(P<0.05),说明aASP具有良好的免疫刺激效果,免疫细胞偏向CD4+T细胞分化。

图5 CD4+、CD8a+和CD4+/CD8a+ T细胞的流式图(A、B、C)和细胞统计图(D、E、F)Fig.5 Flow cytometry(A,B,C)and T cell statistics(D,E,F)of CD4+,CD8a+ and CD4+/CD8a+

2.6 aASP对小鼠脾淋巴细胞因子分泌的影响

如图6所示:高、中浓度的aASP均能促进脾脏淋巴细胞IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-4的分泌,分泌水平均显著高于空白对照组(P<0.05),TNF-α和IL-6的分泌水平和LPS组相比无显著性差异(P>0.05),IFN-γ 和IL-4的分泌水平显著高于LPS组(P<0.05),结果说明aASP可诱导小鼠脾脏T淋巴细胞产生Th1(helper T lymphocyte 1)及 Th2(helper T lymphocyte 2)混合型免疫应答。

图6 各试验组对小鼠血清细胞因子分泌水平的影响Fig.6 Effects of experimental groups on serum cytokine secretion levels of mice

酸性多糖中通常含有糖醛酸、硫酸根等官能团,可通过显色法及红外光谱法进行检测。经硫酸-咔唑法检测发现aASP骆驼刺多糖中含有大量糖醛酸,为酸性多糖;红外光谱检测发现aASP在1 746.53 cm-1处有较强的吸收峰,进一步验证aASP为酸性多糖,含有糖醛酸,但不含硫酸根。MTT法常用于检测细胞存活、生长和细胞密度,且重复效果较好[16]。本试验用MTT法检测脾淋巴细胞的最大安全浓度,结果显示aASP在1 000 μg·mL-1无细胞毒性作用,因此判断1 000 μg·mL-1为aASP的最大安全浓度,且具有良好的安全性。aASP协同PHA和LPS刺激脾淋巴细胞结果显示,aASP不仅能够单独刺激脾脏淋巴细胞的增殖,还能协同PHA对小鼠脾T淋巴细胞产生增殖效果,也协同LPS对小鼠B淋巴细胞产生增殖效果。

T淋巴细胞能够调节机体的细胞应答,是适应性免疫系统的主要效应细胞[17-18]。在免疫学研究中,流式细胞术用来计数特定的细胞亚群,T淋巴细胞按表型不同可分为CD4+和CD8+两大亚群,CD4+T细胞可表现出多种功能,主要为Th1亚群和Th2亚群,CD4+T细胞可协助B细胞进行分化,参与细胞免疫应答,而CD8+T细胞则对病原体具有杀伤和抑制作用。Th1和Th2细胞亚型之间的动态平衡在维持生物体的正常免疫功能中起重要作用[19-20]。本试验结果显示,aASP能够促进CD4+和CD8a+T细胞的分化,aASP刺激T细胞分化结果显示,高、中浓度aASP刺激T细胞CD4+/CD8a+比值和LPS组相比无显著性差异,可以进一步确定aASP具有良好的免疫刺激效果,免疫细胞偏向CD4+T细胞分化。

细胞因子是一类能在细胞间传递信息且有免疫调节效应的蛋白质或小分子多肽,是免疫反应的介质,是CD4+T细胞功能激活和增殖的重要标志[21-22]。Th1型细胞分泌TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-12等细胞因子,Th2型细胞分泌IL-6、IL-4、IL-5、IL-10等细胞因子[23-25]。Thl型细胞分泌的细胞因子,具有介导细胞免疫应答和促进CD8a+T细胞分化成熟的功能;Th2型分泌的细胞因子,具有介导体液免疫应答的功能。本试验结果表明,高、中浓度的aASP可显著促进脾脏淋巴细胞IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-4的分泌,IFN-γ和 IL-4 的分泌水平显著高于LPS组,表明aASP能够促进小鼠脾淋巴细胞产生Th1和Th2混合型免疫应答。

综上,aASP可以促进小鼠脾脏淋巴细胞的增殖,诱导小鼠脾脏T淋巴细胞产生Th1及Th2混合型免疫反应,促使T细胞偏向CD4+细胞分化。说明aASP对脾淋巴细胞增殖效应较强,具有一定开发价值。

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