拓扑异构酶Ⅱα蛋白在青年女性乳腺癌中的表达及其预后的关系*
时间：2023-06-05 09:00:29 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
林凤村，李艺江，林延宗，黄建丽
(1.福建医科大学附属漳州市医院肿瘤放疗科，福建 漳州 363000；
2.厦门大学附属第一医院普通外科，福建 厦门 361000)
世界卫生组织下属的国际癌症研究机构(IARC)发布的《2020全球癌症报告》显示，乳腺癌一跃成为全球第一大癌，并且呈年轻化趋势。第15届St.Gallen国际乳腺癌大会提出根据乳腺癌患者的临床病理特征和分子分型，对个体治疗方案进行相应的“增和减”，从而最大限度避免治疗不足或治疗过度，实现“量体裁衣”的个体化治疗，从而提高乳腺癌的治疗效果[1]。目前，中国女性乳腺癌的发病率呈显著上升且日益年轻化的趋势，加强对乳腺癌分子水平研究，寻找预后分子至关重要[2]。DNA拓扑异构酶Ⅱα(TopoⅡα)在DNA的复制、重组和转录等过程中发挥重要作用。既往研究证实，TopoⅡα与乳腺癌患者对蒽环类药物的反应性有关，其蛋白高表达的患者对蒽环类药物更敏感，疗效更好[3]。然而，在蒽环类药物广泛使用的背景下，TopoⅡα对青年乳腺癌患者的预后影响尚存争议。国内外相关临床研究十分有限，并且缺乏长期随访报道。因此，本研究纳入50例<35岁的青年乳腺癌患者，检测其癌组织中TopoⅡα蛋白的表达，通过10余年的长期随访，分析其与患者无病生存期(DFS)、总生存期(OS)之间的关系，为预测青年乳腺癌患者的预后提供参考。
1.1一般资料 选取2004年8月至2009年1月福建医科大学附属漳州市医院诊治的青年(<35岁)乳腺癌患者共131例。纳入标准：(1)经2位高年资病理科医师分别阅片后确诊为原发性乳腺癌；
(2)施行过根治手术，包括乳腺癌根治术和改良根治术；
(3)完整的术后病理资料，免疫组织化学检测项目包括激素受体(HR)、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、增殖细胞核抗原Ki67、TopoⅡα蛋白；
(4)术前未行放化疗及内分泌治疗；
(5)术后符合2017版NCCN指南要求进行辅助化疗6～8 周期，具体化疗方案以蒽环为主或联合紫杉醇的方案(包括AC，EC，TAC，AC-T等)，无法耐受蒽环类的心脏毒性者选用不含蒽环类的联合化疗方案(包括TC，CMF等)。排除标准:(1)确诊时即已发生远处转移；
(2)局部复发病例、双侧乳腺癌、病理结果为DCIS；
(3)失访病例；
(4)术后未符合2017版NCCN指南的要求进行辅助化疗。
经筛选，最终纳入50例患者进行研究，患者中位年龄32岁。其中，浸润性导管癌31例，浸润性小叶癌9例，单纯癌5例，髓样癌3例，黏液癌2例。肿瘤分期方面，I期患者8例，Ⅱ期患者26例，Ⅲ期患者 16例。收集的临床病理资料包括肿瘤大小(T分期)、淋巴结转移(N分期)、TNM分期、HR、ER、PR、HER-2、Ki67和分子分型。主要研究终点为DFS，定义为确诊日期起至复发转移或由于疾病进展导致患者死亡的时间间隔；
次要研究终点为OS，定义为确诊日期起至死亡或末次随访时间(2020年11月19日)；
中位随访时间为159个月(131～195个月)。本研究已获得医院伦理委员会批准。
1.2免疫组织化学检测
1.2.1HR、ER、PR、HER-2表达及分子分型的判断标准 (1)HR、ER、PR表达：以ER或PR表达 < 10%为(-)，≥ 10%为(+)[4]，ER或PR其中一个阳性，即为HR阳性；
(2)HER-2表达：由于大部分患者未进行Fish检测，故定义HER-2 +或-为HER-2表达(-)，HER-2呈2+和3+为HER-2表达(+)[5]；
(3)Ki67表达：≤ 14%定义为低表达，> 14%定义为高表达[6]；
(4)分子分型：根据St Gallen共识分为luminal A、luminal B、HER-2过表达和三阴性乳腺癌。
1.2.2TopoⅡα蛋白测定 将所有标本固定于甲醛中，以石蜡包埋，连续切片并脱蜡水化，PBS液洗涤。置于缓冲液中，持续加热，冷却后用抗原修复。用PBS液冲洗后滴加稀释的一抗，并采用PBS代替一抗作为阴性对照，相同条件下已知阳性切片作阳性对照。PBS液洗涤后滴加二抗并孵育。弃去PBS液，滴加新鲜配制的 DAB 显色液，进行阅片。TopoⅡα单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发公司。结果判定：TopoⅡα蛋白位于细胞核上，呈黄棕色颗粒状。随机计数视野中500个癌细胞，统计阳性细胞的百分数。定义着色癌细胞 < 25%为低表达，≥ 25%为高表达[7-8]。
1.2.3随访 50例患者均经密切随访，无失访病例。2年内每间隔3个月随访1次，之后每间隔6个月随访1次。随访方式包括调取来诊记录、影像材料和电话随访等。末次随访日期为2020年11月19日。
1.3统计学处理 应用SPSS22.0统计软件进行数据分析，采用χ2检验(Pearson法、连续性校正法及Fisher确切概率法)分析TopoⅡα蛋白表达与临床病理特征的关系，相关性分析采用Spearman分析法。采用Kaplan-Meier法绘制患者生存曲线，用log-rank检验分析各亚组之间生存率的差异。多因素分析采用Cox比例风险回归模型。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1TopoⅡα蛋白在青年女性乳腺癌组织中的表达 50例患者中，42例患者TopoⅡα蛋白表达呈阳性，其中I期8例，Ⅱ期20例，Ⅲ 期14例；
浸润性导管癌25例，浸润性小叶癌9例，单纯癌4例，髓样癌3例，黏液癌1例。
2.2TopoⅡα蛋白表达与临床病理特征的关系 TopoⅡα蛋白表达仅与增殖细胞核抗原Ki67呈正相关(r=0.533，P=0.002)，与患者肿瘤大小(T分期)、淋巴结转移、TNM分期、分子分型、ER、PR、HER-2均无关(P>0.05)，见表1。
表1 TopoⅡα蛋白表达与青年女性乳腺癌患者临床病理特征的关系
续表1 TopoⅡα蛋白表达与青年女性乳腺癌患者临床病理特征的关系
2.3复发和转移情况 随访至2020年11月19日，50例患者中有23例发生复发、转移，转移部位依次为骨、肺、肝、脑。其中淋巴结转移情况、HR状态、ER、PR、分子分型、TNM分期和TopoⅡα蛋白表达均与DFS有关(P=0.014，P=0.002，P=0.001，P=0.020，P=0.001，P=0.026，P=0.003)，见表2，即TopoⅡα蛋白阳性、无淋巴结转移、ER或PR阳性、病理类型为luminal A型、I/Ⅱ期患者的DFS较长。
表2 青年女性乳腺癌患者DFS的单因素分析
2.4TopoⅡα蛋白表达与DFS和OS的关系 TopoⅡα蛋白表达与患者的DFS显著相关(χ2=9.105，P=0.003)，见图1。TopoⅡα蛋白阳性者与阴性者相比DFS更优，其1、3、5、10年DFS分别为95.2%：87.5%、76.2%：37.5%、66.7%：12.5%、64.3%：12.5%，差异有统计学意义(χ2=9.105；
P=0.003)。见表2。
图1 青年女性乳腺癌患者TopoⅡα蛋白表达的无病生存曲线
2.5TopoⅡα蛋白阳性者与阴性者比较 TopoⅡα蛋白阳性者与阴性者1、3、5、10年OS分别为97.6%：100%、81.0%：62.5%、73.8%：50.0%、73.8%：50.0%，差异均无统计学意义(χ2=1.652,P=0.199)。见图2、表3。
图2 青年女性乳腺癌患者TopoⅡα蛋白表达的总生存曲线
表3 青年女性乳腺癌患者OS的单因素分析
续表3 青年女性乳腺癌患者OS的单因素分析
2.6多因素Cox比例风险回归模型分析 将单因素生存分析中影响DFS(P<0.05)的因素(淋巴结转移、激素受体、分子分型、TNM分期、TopoⅡα蛋白表达)纳入多因素COX回归模型进一步分析，结果表明：TopoⅡα蛋白阴性、HR阴性、TNM分期较晚(Ⅲ期)是影响青年乳腺癌患者DFS的独立危险因素[风险比(HR)=0.272,95%CI:0.110～0.674,P=0.005；
HR=0.225,95%CI:0.090～0.567,P=0.002；
HR=3.027,95%CI:1.280～7.157,P=0.012]。见表4。
表4 青年女性乳腺癌患者DFS的多因素分析
2.7青年女性乳腺癌患者OS的多因素分析 将单因素中影响OS(P<0.05)的因素(淋巴结转移、HR、分子分型、TNM分期)纳入多因素COX回归模型进一步分析，结果表明：淋巴结转移、HR阴性、TNM分期较晚(Ⅲ期)是影响OS的独立危险因素 (HR=5.531,95%CI:1.149～26.620,P=0.033；
HR=0.135,95%CI:0.042～0.431,P=0.001；
HR=4.856,95%CI:1.596～14.771,P=0.005)。见表5。
表5 青年女性乳腺癌患者OS的多因素分析
乳腺癌已经成为全球发病人数最多的恶性肿瘤，在中国恶性肿瘤中发病率与病死率均位居前列[9]。20世纪70年代以来，蒽环类药物在乳腺癌化疗领域展现出的优势已受到学者们的重视，时至今日仍作为乳腺癌经典化疗方案的重要组成部分。但随着研究的深入，乳腺癌分子层面的差异对蒽环类化疗效果的影响越来越受关注[10]。其中，不得不提的就是TopoⅡα蛋白。它是一种存在于细胞核内，可调节DNA空间变化的关键酶，其通过改变核酸上磷酸骨架的构象，使得DNA双螺旋中的1条或2条链暂时断裂，从而完成了超螺旋状态与解旋状态之间的相互转换[11]。蒽环类药物插入TopoⅡα与DNA 结合处，干扰DNA断端的重新连接，使其无法修复，达到抑制肿瘤细胞分裂增殖的作用。TopoⅡα蛋白表达缺失常常引起蒽环类药物耐药，而高表达者则对蒽环类药物敏感[12]。
谢闵等[13]报道，TopoⅡ在三阴性乳腺癌中阳性率高达91.30%，而在非三阴性乳腺癌中阳性率为71.40%。李梅芳等[14]研究发现，青年组乳腺癌患者的TopoⅡα蛋白表达较中年组和老年组患者高，青年乳腺癌患者(≤ 40岁)、中年组(42～64岁)和老年组(≥ 65 岁)的TopoⅡα蛋白阳性率分别为51.6%、36.9%和33.7%。李铁灵等[15]则报道了在青年乳腺癌(<40岁)患者中，TopoⅡα蛋白阳性表达率为45.2%。纵观以上几项研究结果，受检测仪器、观察人员、阳性界值、实验操作流程等因素的影响，TopoⅡα蛋白表达率存在一定的差异。在本研究中，TopoⅡα蛋白阳性表达率高达84.0%。相较中老年患者而言，青年患者TopoⅡα蛋白呈高表达趋势[16]，这可能与TopoⅡα蛋白大多表达于细胞增殖分裂期，而青年患者癌细胞增殖迅速有关。Ki-67亦与细胞增殖密切相关，被认为是一种能有效评估肿瘤细胞增殖活性的重要分子[17]。国外研究发现，TopoⅡα蛋白表达与Ki-67显著相关，TopoⅡα蛋白表达增高的肿瘤更具增殖潜能[18-20]。况丽平等[21]认为，乳腺癌患者的TopoⅡα蛋白和 Ki-67在乳腺癌的发生、发展中具有相互协同的作用，可作为判断乳腺癌预后的重要指标。本研究中，TopoⅡα蛋白与Ki-67表达呈显著正相关，进一步证实了两者之间的联系。乳腺癌患者，尤其是癌细胞增殖更加旺盛的青年患者中，TopoⅡα蛋白与Ki-67共同反映细胞增殖活跃程度。因此，对TopoⅡα蛋白高表达患者进行术后辅助化疗，杀灭更多处于增殖期的肿瘤细胞，使其快速进入G0期，理论上能达到更好的肿瘤控制。此外，笔者认为青年女性乳腺癌患者TopoⅡα蛋白表达与其他临床病理特征(肿瘤大小、TNM分期、激素状态、淋巴结转移等)并不相关，这与国内王云翔等[12]的报道一致，预示着TopoⅡα蛋白并未通过产生不良的肿瘤生物学行为从而影响患者预后。
本研究发现,HR阴性、TNM分期较晚的青年乳腺癌患者更容易发生复发和转移，这一现象在所有年龄段患者中普遍存在。而TopoⅡα蛋白表达对青年患者复发、转移的影响具有其特殊性：一方面，TopoⅡα蛋白高表达的青年患者细胞增殖旺盛，理论上更容易发生肿瘤的复发和转移；
另一方面，高表达TopoⅡα蛋白的乳腺癌组织对蒽环类化疗药具有更高的反应性，可取得更好的化疗效果。综合来看，在蒽环类化疗药物广泛应用的背景下，TopoⅡα蛋白的表达对乳腺癌患者的复发、转移到底产生怎样的影响，目前仍存在争议。中山大学肿瘤中心一项最新研究发现：在434例luminal型早期乳腺癌患者中，TopoⅡα蛋白过表达患者无远处转移生存期缩短，进一步亚组分析表明缺少辅助化疗是TopoⅡα蛋白过表达者预后变差的危险因素之一[4]。NIELSEN等[22]研究了在接受蒽环类化疗的乳腺癌患者中，TopoⅡα基因过表达患者复发率、病死率明显下降，而表达缺失患者预后不良；
SCHINDLBECK等[23]则通过免疫组织化学检测乳腺癌患者(118例均接受EC、EC-CMF、FAC/FEC等含蒽环类方案化疗)TopoⅡα蛋白的表达，中位随访42个月，结果提示TopoⅡα蛋白表达阳性者的OS比阴性者长(P=0.033)；
还有部分学者认为TopoⅡα蛋白表达与预后的关系和乳腺癌分子分型有关，即在HER-2过表达型乳腺癌中，TopoⅡα蛋白阳性组较阴性组5年DFS和OS均明显延长；
而在三阴性乳腺癌中，结果恰恰相反，TopoⅡα蛋白阳性组5年DFS率低于阴性组(P=0.044)[12]。在涉及青年乳腺癌患者的研究中，李铁灵等[15]报道：62例年龄<40岁乳腺癌患者在辅助蒽环类化疗下，其TopoⅡα表达阳性者OS和DFS均长于 TopoⅡα阴性者，研究者认为蒽环类化疗药物的使用，可以改善TopoⅡa阳性青年乳腺癌患者的生存。一项针对256例浸润性乳腺癌患者的研究则显示，TopoⅡα高表达患者虽然OS和DFS有所缩短，但与低表达者相比，差异无统计学意义[24]。本研究长期随访(中位随访期达159个月)结果表明，TopoⅡα阳性表达的青年乳腺癌患者，其DFS较阴性者明显延长。同时，多因素分析也提示TopoⅡα表达是影响DFS的独立预后因素。因而，对肿瘤细胞增生活跃的青年乳腺癌患者，术后使用蒽环类化疗，可以在一定程度上降低TopoⅡα蛋白阳性患者的局部复发率，延长DFS，提高患者的生活质量。而在OS方面，TopoⅡα蛋白表达的高低对患者的OS没有产生影响，意味着TopoⅡα蛋白表达状态不影响青年乳腺癌患者的远期预后，这也与SHEEN-CHEN等[25]的结论相符。他们对94例乳腺癌患者进行研究后，发现TopoⅡα蛋白表达与患者5年生存率无关，无法成为乳腺癌OS的预测因素。笔者认为，影响OS的主要因素还是取决于肿瘤的临床病理状态。淋巴结有转移、HR阴性、TNM分期较晚的患者OS大大缩短，这些均是影响患者预后的独立危险因素，而TopoⅡα蛋白表达与这些因素未显示出相关性。因此，它对OS的影响也就十分有限。
在乳腺癌治疗中，TopoⅡα蛋白表达能否影响乳腺癌的预后一直存在争议，并且针对青年乳腺癌患者这一特殊群体，TopoⅡα表达的研究数据也十分有限。本研究严格筛选了50例年龄<35岁的青年女性乳腺癌患者，通过免疫组织化学进行TopoⅡα蛋白的检测，经过长达10余年的随访，得出结论：TopoⅡα高表达的青年乳腺癌患者有更长的DFS，而OS不受其表达高低的影响。揭示了TopoⅡα蛋白在青年女性乳腺癌患者行蒽环类化疗时的重要预测作用，能够更好地指导临床用药，从而造福更多的青年患者。本研究同样存在一定的不足，例如：样本量较少；
未检测基因扩增及mRNA表达；
未对HER-2进行FISH检测，研究结果有待于大样本前瞻性实验的进一步证实。相信对TopoⅡα的深入研究，将会为青年乳腺癌患者的个体化治疗开辟新的途径并带来新的希望。
