紫罗兰挥发物化学成分分析及促生活性物质鉴定*

姚汉央，弓雅婧，苏宏鼎，杨荣亮，杜 飞，杨 敏，朱书生，邓维萍

(1.云南农业大学 植物保护学院，云南 昆明 650201；
2.云南农业大学 理学院，云南 昆明 650201)

紫罗兰[Matthiola incana(L.) R.Br.]是十字花科(Cruciferae)紫罗兰属(Matthiola) 1～2 年生亚灌木状草本花卉，花开时色艳香浓，种子油富含ω-3-亚麻酸，是广泛种植的观赏花卉之一，也是新的特用油料植物，具有较高的经济价值[1-2]。作物多样性种植是促生控病行之有效的方法，其方式包括轮作、间作、套作和伴生种植等[3]。课题组前期研究发现：将紫罗兰与葡萄间作能促进葡萄生长，提升果实品质[4]。目前已知的多样性种植促生机制包括土壤理化性质改良、土壤微生物群落改变、微气候调节和植物间有利的化感作用[5-6]。植物化感作用是指植物通过向环境中释放化学物质而对其他植物或微生物产生直接或间接的有利或不利影响的过程[7]。挥发是植物化感作用的形式之一，挥发物是植物—植物互作的重要物质载体，构成挥发物的各成分种类和功能多样，对植物生长的影响各不相同[8]。因此，探明紫罗兰挥发物的主要成分并确定其中的促生活性物质，不仅可为开发植物源生长调节剂提供选择参考，也可为解释葡萄与紫罗兰多样性种植促生提质效果提供理论依据。

植物挥发性有机物(volatile organic compounds，VOCs)是通过植物体内次生代谢途径合成的低沸点、易挥发的小分子化合物，可作为信号分子介导植物间长距离互作[9]。研究发现：许多植物释放的VOCs 通常会影响周围其他植物生长，体现“相生相克”效应[8]，有的对周围植物产生促进作用，有的则产生抑制作用。如斑点矢车菊根部释放的倍半萜类挥发物可促进相邻植物根部和叶部生长[10]；
青蒜挥发物能促进黄瓜幼苗生长，提高幼苗抗氧化酶活性及抗氧化物质积累[11]；
分蘖洋葱伴生番茄可显著提高番茄生长势，其叶片挥发物对番茄幼苗有“低促高抑”效果[12]；
牛至挥发物能抑制小麦幼根生长[13]；
胜红蓟茎叶挥发物可显著抑制稗草、黑麦草和三叶鬼针草幼苗和根的生长[14]；
马唐植株地上部分挥发物可抑制大豆、向日葵、玉米和小麦等多种农田作物生长[15]。许多学者进一步对挥发物中的单体生物活性进行分析研究，以期找到有化感作用的活性物质。如埃及车轴草、毛野豌豆和绛三叶草释放的(E)-2-己烯醛对洋葱、胡萝卜和番茄种子萌发的抑制作用最强[10]；
银胶菊挥发的香叶烯、罗勒烯和β-蒎烯对苘麻(Abutilon theophrasti)和稗草(Echinochloa crusgalli)种子萌发和幼苗生长的作用强度不同，3 种单体及其两两混配组合均抑制苘麻和稗幼苗生长，而部分促进其种子萌发[16]。目前关于紫罗兰的研究主要集中于其花期调控和栽培生产[17-19]，未见有关紫罗兰挥发物化学成分分析以及各单一成分化感作用的研究报道。本研究采用常温常压吹气法收集紫罗兰VOCs，利用GC-MS 检测分析其化学成分，并采用种子萌发和幼苗生长试验筛选其促生活性物质，以期找到有促生效果的紫罗兰挥发性单体，为利用化感物质开发新型的生态植物源生长调节剂提供参考。

1.1 材料

紫罗兰种子(品种：Stock Yume no Uta)购自云南霖成花卉有限公司，在云南农业大学教育部农业生物多样性与病害控制重点实验室温室自行栽培；
生菜种子购自山东潍坊寿光市欣瑞农业科技有限公司。促生活性鉴定中所用化学试剂(分析纯)均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，除α-金合欢烯和β-金合欢烯仅购得α+β 金合欢烯混合液外，其他试剂均为单一纯品。

1.2 方法

1.2.1 紫罗兰VOCs 收集和鉴定

采用改进后的常温常压吹气法[20]收集紫罗兰活体VOCs。用锡箔纸包裹紫罗兰植株根部(避免根部挥发物影响)，放入洗净且干燥的干燥缸中，盖上盖，用Parafilm 封口膜密封。用气体采样仪(QC-1B 型，北京市劳动保护科学研究所)抽气，速率为400～600 mL/min。用活性炭和硅胶吸收抽入空气中的水分和杂质，吸附柱(PorapakTMQ)吸附挥发物。重复3 次，以空缸为对照。收集3 d后，用正己烷(色谱纯，99.9%，赛默飞世尔科技有限公司)淋洗吸附柱，淋洗液用高纯氮气浓缩至1～2 mL。浓缩液送中国科学院昆明植物研究所进行GC-MS 检测分析(Agilent Technologies 公司，HP6890GC/5973MS 气相色谱-质谱联用仪)，利用wiley7n.1 标准谱库进行检索对比鉴定挥发物成分，并用标准品进行确证。

1.2.2 筛选VOCs 中的促生活性物质

选取籽粒饱满、活力指数均一的生菜种子，表面消毒后放置在垫有湿润滤纸的培养皿(直径9 cm)中，每皿20 粒种子。选取紫罗兰挥发物中相对含量＞0.05%的主要成分，用正己烷(分析纯)配制成5×104mg/L 的母液，分别移取0.42、0.84、1.68、3.36、5.04、6.72、8.40、16.80、42.00和84.00 μL 母液装于离心管盖中，为调节挥发速率趋于一致，分别对应加入正己烷199.58、199.16、198.32、196.64、194.96、193.28、191.6、183.2、158 和116 μL，将离心管盖放入培养皿中，分别形成0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0、50.0 和100.0 mg/L 的挥发性气体。盖上皿盖，用封口膜密封，将培养皿放置于光照培养箱中培养(25 ℃，光照12 h/黑暗12 h)。以200 μL 正己烷和纯水分别作为对照，每个处理3 次重复。6 d后统计最终萌发率，并测量株高、根长和鲜质量等生长指标。按下列公式计算种子萌发率(germination rate，GR)以及不同挥发物对生菜种子萌发、幼苗茎长、根长及鲜质量的化感效应指数(response index，RI)和化感综合效应(synthetic effect，SE)[21]。

式中：T为处理值；
C为对照值；
n为化感效应指数数量。RI＞0，表示促进作用；
RI＜0，表示抑制作用；
RI 绝对值代表化感作用强度大小。

1.3 数据处理

用Excel 2016 和GraphPad Prism 8 软件对数据进行处理和作图；
采用SPSS 18.0 软件进行差异性分析(Duncan’s post hoc ANOVA)。

2.1 紫罗兰VOCs 主要成分

利用GC-MS 鉴定出紫罗兰挥发物中的60 种化学成分，其中相对含量大于0.05%的有37 种(表1)，包含酯类18 种、萜烯类8 种、醇类3 种、酮类3 种、酚类2 种、烃类2 种和醛类1 种。其中，萜烯类相对含量最高，占总相对含量的25.41%。

表1 紫罗兰挥发物中的37 种主要成分(按保留时间先后顺序列出)Tab.1 37 main compounds in hoary stock VOCs (listed in order of retention time)

2.2 紫罗兰VOCs 主要成分对生菜种子萌发的影响

以化感效应指数(RI)值的大小衡量各挥发物对生菜种子的化感作用，结果显示(图1a)：10 种挥发物按RI 从高到低依次为丙二酸二乙酯、丁香酚、茴香脑、丙酸乙酯、苯甲酸乙酯、3-己醇、1-十二烯、十三烷、乙酸异戊酯、α-蒎烯，在0.5～100.0 mg/L 的平均RI＞0，促进种子萌发，其中丙二酸二乙酯、丁香酚和茴香脑的促进效果最显著(P＜0.05)，平均RI 值分别为0.30、0.20 和0.16。丙二酸二乙酯在0.5 mg/L 时生菜种子萌发率最高，比对照提高59.26%，随着质量浓度增大萌发率有所降低，但均高于对照(图1b)；
丁香酚在0.5～1.0 mg/L 时生菜种子萌发率最高，相比于对照提高33.33%，随着质量浓度增大萌发率有所降低，但均高于对照(图1c)；
1-十二烯在低质量浓度(0.5～6.0 mg/L)时RI＞0，促进生菜种子萌发，高质量浓度(≥6.0 mg/L)时RI ≤0，抑制种子萌发，平均RI 值为0.50，整体呈现“低促高抑”现象(图1d)。此外，乙酸戊酯、2-己酮和2-丁烯酸乙酯的平均RI=0，对种子萌发总体没有化感作用；
其余23 种挥发物的平均RI＜0，整体抑制萌发。

图1 紫罗兰主要挥发物对生菜种子萌发的影响Fig.1 Effect of the main compounds in hoary stock VOCs on the germination of lettuce seeds

2.3 紫罗兰VOCs 主要成分对生菜幼苗生长的影响

2.3.1 对茎生长的影响

紫罗兰VOCs 中的30 种成分(丁香酚、茴香脑、己酸乙酯、庚酸乙酯、β-石竹烯、1,8-桉树脑、2-甲基-2-丁烯酸乙酯、水杨酸甲酯、苯甲酸乙酯、丙二酸二乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸戊酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、反-2-己烯酸乙酯、十三烷、丙酸乙酯、2-己酮、柠檬烯、α-蒎烯、1-辛烯-3-醇、丁酸乙酯、2-丁烯酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙酸甲酯、3-己醇、乙酸异戊酯、β-蒎烯、戊酸乙酯、1-十二烯和乙醛二乙缩醛)的平均RI＞0，促进生菜幼苗茎生长(图2a)，其中丁香酚和茴香脑的促进效果最显著(P＜0.05)。丁香酚在0.5 mg/L 时生菜茎长增长453.33%，随质量浓度升高增长率逐渐下降(图2b)，茴香脑在0.5～2.0 mg/L 时生菜增长率较高，且随着质量浓度升高呈下降趋势(图2c)。5 种挥发物(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、α+β 金合欢烯和3-己酮)的平均RI=0，对茎生长无化感作用。苯乙醇在0.5～1.0 mg/L 时对生菜茎长略有促进，质量浓度高于1 mg/L 后产生抑制，且随质量浓度升高抑制效果不断增强，平均RI＜0，对茎生长整体呈抑制作用(图2d)。

图2 紫罗兰主要挥发物对生菜幼苗茎生长的影响Fig.2 Effect of the main compounds in hoary stock VOCs on the stem growth of lettuce seedlings

2.3.2 对根生长的影响

紫罗兰VOCs 中有16 种成分(茴香脑、丁香酚、苯乙醇、3-己醇、2-丁烯酸乙酯、庚酸乙酯、柠檬烯、苯乙酸甲酯、丁二酸二乙酯、α-蒎烯、丙二酸二乙酯、己酸乙酯、苯乙酸乙酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、1-十二烯和水杨酸甲酯)的平均RI＞0，促进生菜幼苗根生长(图3a)，其中茴香脑和丁香酚的促进效果显著高于其他成分(P＜0.05)，平均RI 值分别为0.80 和0.74。丁香酚为0.5～10.0 mg/L 时根的增长率随质量浓度增大而增大，质量浓度高于10.0 mg/L 后增长率随质量浓度升高而降低(图3b)；
茴香脑对根的促生效果随质量浓度升高有起伏变化，但无显著差异(P＞0.05)(图3c)；
苯乙醇和柠檬烯在低质量浓度的促生效果优于高质量浓度，苯乙醇的质量浓度≤8 mg/L 时，根的增长率随质量浓度的增大而增大，当质量浓度＞8 mg/L 时，增长率下降(图3d)。其他20 种挥发物(丁酸乙酯、2-己酮、戊酸乙酯、2-甲基-2-丁烯酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸戊酯、3-己酮、反-2-己烯酸乙酯、乙醛二乙缩醛、苯甲酸乙酯、1,8-桉树脑、β-蒎烯、辛酸乙酯、十三烷、α+β 金合欢烯、1-辛烯-3-醇、2-甲基丁酸乙酯、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、丙酸乙酯和β 石竹烯)的平均RI＜0，抑制根生长(图3a)。

图3 紫罗兰主要挥发物对生菜幼苗根生长的影响Fig.3 Effect of the main compounds in hoary stock VOCs on the root growth of lettuce seedlings

2.3.3 对鲜质量的影响

除苯乙醇和2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的平均RI≤0 外，其他34 种挥发物在0.5～100.0 mg/L 的平均RI＞0，对生菜幼苗的鲜质量均有促进作用(图4a)，其中丁香酚与茴香脑促进效果最显著(P＜0.05)。丁香酚为0.5～20.0 mg/L 时，随质量浓度升高，生菜的鲜质量增加率逐渐增大，质量浓度高于20 mg/L 后增加率略有下降(图4b)；
茴香脑为0.5～2.0 mg/L 时，随质量浓度升高，鲜质量的增加率逐渐增大，质量浓度高于2.0 mg/L 后随着质量浓度升高增加率呈下降趋势(图4c)。苯乙醇在0.5～6.0 mg/L 有一定促进作用，但与对照相比并不显著(P＞0.05)，质量浓度高于6.0 mg/L 后产生抑制，抑制效果随质量浓度升高而升高，整体呈现抑制作用(图4d)

图4 紫罗兰主要挥发物对生菜幼苗鲜质量的影响Fig.4 Effect of the main compounds in hoary stock VOCs on the fresh weight of lettuce seedlings

由表2 可知：丁香酚和茴香脑对生菜各生长指标均有显著的促进作用(P＜0.05)，其综合化感效应较强(SE＞0.50)，其他挥发物对生菜的化感作用根据作用指标和质量浓度的不同而不同。其中，有27.78%的挥发物可促进生菜种子萌发，44.44%的挥发物可促进其根生长，83.33%的挥发可促进其茎生长，94.44%的挥发物可促进其鲜质量增加。可见，紫罗兰挥发物对生菜种子萌发和根生长多体现为抑制作用，而对茎生长和鲜质量则多体现为促进作用，且低质量浓度的促进效果强于高质量浓度。据RI 值判断，对地上部分的化感作用强于对地下部分的化感作用，即茎生长和鲜质量是紫罗兰挥发物对生菜化感作用的敏感指标。

表2 紫罗兰主要挥发物对生菜化感效应总结(按综合效应从高到低排序)Tab.2 Allelopathic effects of the main compounds in hoary stock VOCs on lettuce (listed in order of synthetic effect from high to low)

自MOLISH 首次提出化感作用以来，利用化感物质(包括挥发性和非挥发性物质)对植物、动物和微生物的效应进行农业生产调控和生态恢复，已成为植物学、土壤学、生态学和农学等领域的研究热点[22-23]。植物释放的VOCs 携带着其身份的指纹信息，是介导植物与植物之间“相生相克”化感作用的重要媒介之一[24]。根据合成途径、代谢类型和功能，VOCs 可分为萜烯类、苯基/苯丙烷类和脂肪酸衍生物[ 包括绿叶挥发物(green leaf volatiles，GLVs)在内的醇、醛及其酯类 ]，因其种类不同相应的性质和功能也有所不同[25]。本研究鉴定出紫罗兰挥发物中的60 种化学成分，其中相对含量＞0.05%的有37 种，主要是萜烯类、酯类、醇类、酮类、酚类和醛类。与十字花科菘蓝属植物板蓝根挥发物主要成分[26]相比，两者虽都有这7 大类物质，但所含单体有同有异，且本研究紫罗兰挥发物中未检测到含硫化合物(异硫氰酸酯和硫氰酸酯等)，这可能是因为紫罗兰和板蓝根虽同科但不同属，也可能与收集及检测的方法不同有关。

研究显示：植物可通过感受到附近植物释放的VOCs 调节生长和生物量分配模式[27]，这种调节是正向还是负向与VOCs 对其作用的部位有关。VOCs 对植物体不同部位的影响不同，经过一定时期的累积，势必会改变植株生物量的分配及总生物量[28-29]。如香茅草释放的VOCs 显著影响玉米和稗草幼苗的总生物量积累[30]；
冷蒿释放的 VOCs 不仅影响草木樨、苏丹草、披碱草和冰草幼苗的总生物量，还改变其生物量分配[31]。以上研究主要是分析混合挥发物的化感作用，对单一成分的活性分析研究较少。植物释放的VOCs往往是多样的，这些VOCs 具有多种生态功能，甚至不同的VOCs 会具有同种生态功能。在介导种内和种间互作时，发挥作用的VOCs 可能是单一分子，也可能是同类或不同类的多个分子形成的分子簇[25]，因此有必要对混合挥发物中的单一成分活性进行鉴定。本研究发现：紫罗兰的37 种主要挥发物对生菜不同部位的化感作用不同，其对地上部分的促进作用强于对地下部分，茎生长和鲜质量是生菜化感作用的敏感指标。37 种主要挥发物中，分别有83.33%和94.44%的单一成分对生菜幼苗茎生长和鲜质量有促进作用，分别有27.78%和44.44%的成分对种子萌发和根生长有促进作用，这些成分既有萜烯也有脂

肪酸衍生物(烃、酯、醇、酚、酮和醛)，其中对种子萌发促进效果最显著的是丙二酸二乙酯、丁香酚和茴香脑，对茎、根和鲜质量促进效果最显著的是丁香酚和茴香脑。已有研究中也有类似结论，如李奥欣等[32]发现：桉树中的α-松油醇对反枝苋地上部分的化感作用最显著，对地下部分没有明显作用；
艾的茎叶产生的VOCs 对稗草、三叶鬼针草和青葙幼苗根长和苗高的抑制程度存在差异[33]；
冷蒿释放的VOCs 对草木樨、苏丹草、披碱草和冰草幼苗根生长的抑制作用大于幼芽[31]。

化感物质对受体植物的作用强度与其浓度密切相关[22]。陈业兵[34]研究发现：银胶菊水浸提液对苘麻和稗草有不同程度的化感作用，总体上呈现“低促高抑”的现象，且随着溶液浓度增大抑制作用增强。紫茎泽兰VOCs 对云南松种子萌发和幼苗生长呈现高质量浓度抑制作用强烈、随质量浓度降低抑制作用减弱的规律[35]。本研究中紫罗兰挥发物对生菜化感作用的强弱也与质量浓度有关，总体趋势是低质量浓度化感作用强于高质量浓度。在紫罗兰37 种主要挥发物中，丁香酚和茴香脑的化感效应最显著，对生菜种子萌发、茎和根生长及鲜质量均有较强的促进作用，其综合化感效应整体呈现随质量浓度增大而降低的趋势。目前关于丁香酚和茴香脑的研究主要针对其抗菌活性，如丁香酚对胶孢炭疽菌和链格孢有较好的抑菌作用[36]；
茴香脑对烟曲霉菌和酿酒酵母菌有抑制活性[37]，但未见其促生活性的研究报道。因此，有必要在将来的研究中多选用几种植物种子进一步验证紫罗兰挥发物对植物各生长指标的化感作用是否具有普遍性。

在自然生态系统中，化感物质通常采用协同、加合或拮抗3 种形式共同起作用，从而对受体植物产生促进或抑制效应[38]。EINHELLIG[39]报道将水杨酸、伞形酮和芸香苷2 种或3 种混合，对高粱幼苗生长存在加合作用；
对-羟基苯甲酸、阿魏酸和香草酸对抑制棉花种子萌发存在协同效应[40]。本研究仅初步确定了紫罗兰挥发物中各单体化合物的化感活性，而它们之间的相互作用还有待于进一步研究。

挥发物促生机制一方面是直接调控植物生理生化过程，如影响受体植物体内激素的合成和利用，从而改变细胞的分裂和伸长；
影响膜的透性、植物对矿物质的吸收和对水分的传导作用、光合和呼吸作用以及蛋白质合成等[41-42]；
另一方面是仅作为媒介，通过调节土壤微生物和生态环境间接影响植物生长[43]。本研究仅确定了紫罗兰VOCs 中存在促生活性物质，但其促生机理尚未明确，需要进一步分析活性物质主要影响植物的哪些生理生态过程，以明确其化感作用的机理。

紫罗兰挥发物含有37 种主要化学成分，单一成分对受体植物化感作用的方向(促进或抑制)和强弱与作用部位和质量浓度密切相关，其中有10 种成分对种子萌发有促进作用，30 种成分对茎生长有促进作用，34 种成分对鲜质量有促进作用，16 种成分对根生长有促进作用，茎生长和鲜质量是其化感作用的敏感指标。促生活性具有质量浓度效应，整体出现“低促高抑”现象。对种子萌发促进效果最显著的是丙二酸二乙酯、丁香酚和茴香脑，对茎、根和鲜质量促进效果最显著的是丁香酚和茴香脑，因此，丁香酚和茴香脑的综合化感效应最强，可作为植物源生长调节剂加以开发和利用。

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