横向定量牵拉损伤对大鼠视网膜神经节细胞自噬水平的影响
时间：2023-06-03 20:50:14 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
尚孟秋，廖 良，吴 琼，孙 武，夏燕婷，王露露，王 妍，曹琳琳
外伤性视神经病变(traumatic optic neuropathy，TON)在闭合性头颅外伤中约占2%～5%[1]，是眼外伤的重要急症之一，也是头部损伤中的严重并发症之一。该病预后不佳，患者常出现急性视功能下降，超过60%的患者视力仅为光感甚至无光感[2]。目前治疗视神经损伤的方法主要有视神经管减压术和激素冲击治疗等。然而，目前还没有一种药物或手术方法对受损视神经的保护有明确的疗效。探究视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)的损伤机制、寻求更有效的保护RGCs的措施是研究TON的热点。实验动物模型是研究TON损伤保护的关键技术之一，本课题组前期实验证实横向定量牵拉法可导致大鼠RGCs损伤[3]，但损伤的具体机制尚待进一步研究。大量研究发现，自噬(autophagy)的发生与细胞凋亡、坏死密切相关。自噬是细胞在应激条件下的一种自我保护过程，细胞在外界环境因素的影响下，对其内部受损的细胞器、错误折叠蛋白质和侵入其内的病原体进行降解；
病理条件下，自噬作为适应性应激反应能够有效促进细胞存活[4]，这对外伤后RGCs的保护非常重要。为进一步研究自噬对TON后RGCs的影响，本研究运用闪光视觉诱发电位(flash visual evoked potential，f-VEP)技术与分子生物学技术探索牵拉伤对大鼠RGCs自噬水平的影响。
1.1材料
1.1.1实验动物及分组选择SPF级健康雄性SD大鼠30只(购自北京维通利华实验动物有限公司)，体质量220±20g，双眼外观正常，检查双眼屈光间质清，瞳孔等大等圆，对光反射灵敏，眼底无异常。饲养于北京中医药大学东方医院实验中心，自由摄食、饮水，室内通风干燥。按照随机数字表分为空白组、假手术组、0.15N(牛顿)组、0.3N组、0.6N组，每组各6只。本研究通过北京中医药大学动物实验伦理审查(No.202007)。
1.1.2主要试剂和仪器设备主要试剂：苏木素染液(MDL，货号MD911477)；
DAB kit(中杉金桥，货号ZLI-9017)；
LC3B抗体(Cell signaling，货号83506s)；
Brn-3a抗体(Abcam，货号ab245230)；
二抗(MDL，货号MD912566)。主要仪器设备：石蜡切片机(Leica，RM2235)；
显微镜(Leica，DM3000)；
电泳仪(北京百晶生物技术有限公司，BG-subMIDI)；
ChemiDoc MP化学发光成像系统(Bio-rad，170-8280)。
1.2方法
1.2.1视神经牵拉伤模型构建采用横向定量牵拉法制作视神经损伤大鼠模型[5]，具体方法如下：2%戊巴比妥钠腹腔注射全身麻醉大鼠，待角膜反射消失，用镊子轻夹下肢脚趾无反应时即为麻醉成功；
麻醉成功后取俯卧位，在体式显微镜下操作，剪开大鼠右眼颞侧眶缘皮肤约1cm，摘除部分眶脂肪，剪断(亦可保留)上直肌和外直肌，向眶尖部钝性分离直至暴露视神经，采用6-0聚酯缝合线在球后1～2mm处圈住视神经并打结(圈长等于视神经横截面周长，注意不能拉紧)，缝线另一头连接横向拉力计(最小刻度0.01N)，根据分组不同，以0.15、0.3、0.6N拉力垂直于视神经水平牵拉并持续20s。牵拉完成后立即观察，如术眼瞳孔散大、直接对光反射消失、间接对光反射存在、眼底视网膜无血管闭塞，则为造模成功。空白组大鼠不予处理。假手术组仅暴露视神经，不予牵拉。造模成功后，将眼球恢复原位，缝合伤口，在眼睑上涂用红霉素眼膏敷眼以抗炎，后将大鼠放回笼中，观察呼吸有无异常。
1.2.2f-VEP测量各组随机选择大鼠1只，于造模后第1、3d将大鼠暗适应2h；
麻醉方法同前；
麻醉成功后将大鼠固定于视觉电生理仪托盘上，双眼各点1滴复方托吡卡胺充分散瞳；
对侧眼使用不透光眼罩遮盖；
连接电极，记录电极从双耳连线中点皮下向头侧进针约1cm，参考电极置于待查眼的同侧颊部，地电极置于尾部皮下；
使用眼科罗兰电生理仪进行测量，每只眼球重复测量3次，使用仪器自动峰型识别确定实验大鼠f-VEP P2潜伏期和振幅(其中P2振幅为P2-N2数值)。
1.2.3取材各组均于造模后第3d取材。10%水合氯醛过量麻醉处死大鼠，完整摘取眼球，每组随机选取2只眼球投入多聚甲醛固定液中进行免疫组织化学和透射电子显微镜观察，其余4只眼球置于冰上分离视网膜，沿冠状面剪去角膜、虹膜及晶状体，用镊子缓慢钝性分离视网膜，小心剥离视网膜置于冻存管中，立即投入液氮保存。
1.2.3.1免疫组织化学染色观察RGCs存活情况视网膜组织切片脱脂，逐次水化，去除过氧化物酶，抗原修复，羊血清封闭后，加入一抗Brn-3a抗体(1∶200)，4℃摇床孵育过夜，加入相应的二抗，于37℃恒温箱中孵育，PBS冲洗，DAB显色，苏木精复染，梯度脱水，烤干封片。每张切片随机选取10个高倍视野，采用定量软件Image J分析结果，蓝色有核细胞数量为视网膜神经节细胞层(GCL)细胞总数，棕色细胞数量为含Brn-3a蛋白的细胞(阳性细胞)数，即RGCs存活细胞数，记录各组GCL层的细胞总数和阳性细胞数，计算阳性细胞百分比。
1.2.3.2透射电子显微镜观察自噬小体变化视网膜组织经1%锇酸固定、2%醋酸水溶液快速染色、乙醇脱水、浸透、包埋、切片后，采用醋酸铀和枸橼酸铅进行双重染色后用清水洗净，置于透射电子显微镜下观察视网膜组织中自噬小体并拍照记录。
1.2.3.3Westernblotting检测视网膜组织中自噬相关蛋白表达水平取视网膜组织，每组4个视网膜混合为1个样本，冰浴超声裂解组织后，用BCA法测定蛋白浓度，取60μg样品，加入Buffer缓冲液，混匀。100℃沸水处理10min，蛋白变性。采用蛋白质印迹Western blotting法检测视网膜组织自噬相关蛋白LC3BⅡ/Ⅰ表达水平。β-actin作为内参。UVP软件采集图片结果，Image J软件计算各组灰度值。
2.1各组大鼠f-VEPP2潜伏期和振幅比较造模后第1、3d，各组大鼠f-VEP检查均可引出正常N-P-N波形。与假手术组相比，造模后第1d，各模型组手术眼振幅及潜伏期差异均无统计学意义(P>0.05)，但造模后第3d各模型组手术眼振幅均降低，潜伏期延长，差异均有统计学意义(P<0.05)，表明造模后大鼠视神经传导功能下降。此外，造模后第3d，各模型组手术眼潜伏期较造模后第1d延长，但差异均无统计学意义(P>0.05)，见图1，表1。
表1 各组大鼠手术眼f-VEP P2潜伏期和振幅比较
图1 各组大鼠f-VEP P2潜伏期和振幅比较 A：造模后第1d；
B：造模后第3d。
2.2各组大鼠RGCs存活情况各组大鼠视网膜GCL层均可见Brn-3a表达，阳性细胞百分比差异有统计学意义(F=11.05，P=0.001)，0.15N组、0.3N组、0.6N组阳性细胞百分比低于假手术组，0.6N组阳性细胞百分比低于0.15N组和0.3N组，差异均有统计学意义(P<0.05)。表明模型组RGCs存活率低于假手术组，且0.6N组较0.15N组和0.3N组低，见图2，表2。
表2 各组大鼠视网膜GCL层阳性细胞百分比
图2 免疫组织化学染色观察各组大鼠RGCs存活情况 A：空白组；
B：假手术组；
C：0.15N组；
D：0.3N组；
E：0.6N组。RNFL：神经纤维层；
GCL：神经节细胞层；
IPL：内丛状层；
INL：内核层；
OPL：外丛状层；
ONL：外核层。红色箭头：Brn-3a表达阳性细胞；
黑色箭头：其他细胞。
2.3各组大鼠视网膜组织中自噬小体情况空白组和假手术组大鼠RGCs形态较正常，有较完整的细胞核、线粒体、溶酶体，而0.15N组、0.3N组、0.6N组大鼠RGCs形态破坏，出现较多空泡结构，并可见大量增加的溶酶体。各组均可见由膜包裹部分细胞质和细胞内需要降解的细胞器、蛋白质等形成封闭的、圆球形的结构，即自噬小体，见图3。
图3 透射电子显微镜观察各组大鼠视网膜组织中自噬小体 A：空白组；
B：假手术组；
C：0.15N组；
D：0.3N组；
E：0.6N组。每组右图为左图黑色框放大3倍，黑色箭头示自噬小体。
2.4各组大鼠视网膜组织中LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表达水平各组大鼠视网膜组织中LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表达水平比较，差异有统计学意义(F=11.81，P=0.001)。与假手术组相比，模型组LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表达水平均降低，其中0.3N组和0.6N组与假手术组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，LC3BⅡ/Ⅰ表达水平随牵拉力度增加依次递减，但各模型组间差异均无统计学意义(P>0.05)。表明0.3N组和0.6N组大鼠视网膜组织中自噬蛋白表达水平较假手术组降低，见图4，表3。
表3 各组大鼠视网膜组织中LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表达水平比较
图4 Western bloting检测各组大鼠视网膜组织中LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表达水平 A：Western bloting检测结果；
B：Western bloting量化分析结果。
TON是指由于外力冲击造成的急性视神经损伤，其病理机制多为直接或间接性损伤造成的视神经撕断[6]、视神经轴浆流阻断及视神经缺血性梗死，导致RGCs变性坏死，引起RGCs凋亡，最终引起严重的视功能障碍。RGCs的不可逆损伤和选择性丢失是TON发生发展的病理基础[7]。Brn-3a在鼠RGCs的分化、存活及轴突发育过程中具有重要作用，可作为存活的RGCs的标记物，用于体外识别大鼠视网膜RGCs，且其在视网膜损伤后表达模式没有改变，因此，Brn-3a可以作为一种可靠的标记物用于定量评估RGCs的数目[8]。在动物模型中，大鼠f-VEP较易记录，波形易辨认，能反映大鼠视网膜和视觉传导通路基本功能状态的改变，可作为实验中的常规指标使用[9]。f-VEP中P2较为稳健，因此P2潜伏期及P2振幅变化在临床上最为常用[10-11]。P2波峰延迟常见于脱髓鞘疾病，P2振幅降低常见于以视神经轴索变性坏死为主要病理改变的疾病。研究表明，在大鼠缺血性视神经病变模型中，P2振幅可用于评估RGCs的结构和功能，RGCs损失可导致P2振幅衰减[12-13]。本研究结果表明，模型组大鼠f-VEP振幅及RGCs存活率均较假手术组降低，表明成功造成大鼠手术眼出现视神经损伤并引起RGCs改变。
自噬是一种溶酶体依赖性的自我降解途径，其发生的关键是自噬小体的形成，在透射电子显微镜下观察到自噬小体结构是检测自噬发生的金标准。自噬相关蛋白LC3是哺乳动物细胞中酵母自噬相关基因8的同源物，靶向定位于自噬体膜分为Ⅰ型和Ⅱ型[14]。自噬发生时，Ⅰ型与自噬体膜表面的磷脂酰乙醇胺结合，形成Ⅱ型LC3，LC3 Ⅱ蛋白结合并始终位于细胞内自噬体膜上，其含量与自噬泡数量呈正比，被认为是自噬体的标志分子[15]。
本研究发现，视神经牵拉伤3d后大鼠视网膜组织中自噬水平出现下降，且牵拉的力度与自噬水平呈负相关。视神经损伤后自噬产生的时间仍存在争议，Lee等[16]研究发现青光眼模型大鼠在眼压升高7d后自噬蛋白的表达增加具有统计学意义，且第1、3d自噬蛋白表达水平出现下降；
Russo等[17]通过前房加压制备大鼠视网膜缺血、RGCs凋亡模型，造模后第6h自噬蛋白表达增加，第24h自噬蛋白水平下降至与第0h差异无统计学意义。以上研究表明大鼠视神经损伤后的自噬水平可能于第6h, 7d出现两次明显增加，但在6h与7d间自噬水平与损伤前无明显增加甚至下降。本研究结果表明，视神经牵拉伤3d后自噬水平出现下降，且自噬水平与牵拉力度呈负相关，可能与自噬水平高峰未到，同时RGCs的死亡有关。Lee等研究证明自噬激活剂雷帕霉素及饥饿均可提高自噬水平保护高眼压模型大鼠RGCs的存活，自噬可降低RGCs对氧化损伤的反应，抑制细胞凋亡以促进细胞存活[18]，此外神经元自噬可以阻止受损细胞器聚集和神经元中蛋白质的积累，并通过清除轴突碎片或重塑细胞骨架以保护细胞功能[19]。本研究中大鼠视网膜自噬水平与RGCs存活数量呈正相关，证明自噬可能对RGCs具有保护作用。
然而，本研究尚存在不足之处：(1)因f-VEP检查具有个体间差异及重复测量差异大的特点，本研究中各组大鼠P2潜伏期及振幅对比对其视功能的改变的可信度有限，但由于动物实验的局限性，尚无更有效证明大鼠视功能变化的检查；
(2)由于经费限制，本研究每组仅有6只大鼠，样本量较小。基于上述问题，本课题组将开展大样本研究，并进一步探索横向牵拉法影响视网膜组织自噬的分子生物学信号调控机制。
综上所述，横向牵拉法可制作精确定量的视神经损伤模型，并造成手术眼视网膜自噬水平下降、RGCs死亡和相应的神经传导功能障碍，且不同牵拉力造成的损伤程度不同，该模型建立方法难度适中，具有较高可重复性，且可模拟轻、中、重不同程度的TON病变，是开展TON基础研究的良好模型。此外，本研究表明RGCs存活情况可能与其自噬水平有关，这也为通过调节自噬促进TON患者RGCs存活、保护视功能的研究提供了方向。
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