沙库巴曲缬沙坦对心肌梗死后心力衰竭大鼠的心脏保护机制探讨

庞志华，赵伟，田留洋，任颖，李栋，姚朱华△

心力衰竭（心衰）是由于心泵功能降低，不能满足机体组织代谢需要而引起血流动力学改变的临床综合征［1-2］。全世界每年超过100万人被诊断为心衰，其5年生存率仅为50%［3-4］。心衰的发生机制与神经-体液调节活动异常关系密切［5-6］。心衰时，心肌受牵拉可以产生大量的利钠肽［7-8］。脑啡肽酶可以分解利钠肽，但抑制脑啡肽酶会增加血管紧张素Ⅱ水平，损害心血管［9］，故临床上不会单独应用脑啡肽酶抑制剂。血管紧张素受体-脑啡肽酶双重抑制剂（ARNI）治疗心衰临床疗效明显［10-12］。多个临床研究均证实，ARNI可保护心衰患者的脏器功能，改善预后［13-15］，但其作用机制尚不明确。因此，本研究通过构建大鼠心肌梗死后心衰模型，探究ARNI对Fas/FasL通路介导的细胞凋亡以及炎症氧化应激指标的影响，进一步明确ARNI的代表性药物沙库巴曲缬沙坦的心脏保护机制，为更好地治疗心衰提供参考。

1.1 材料 无特定病原体（SPF）级成年雄性SD大鼠60只，8周龄，体质量280～300 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2021-0011，饲养于南开大学生物实验站；
沙库巴曲缬沙坦（商品名：诺欣妥，诺华公司）；
兔抗B淋巴细胞瘤-2基因抗体（Bcl-2，货号ab32124）、兔抗Bcl-2相关的X蛋白抗体（Bax，货号ab32503）、兔抗半胱氨酸蛋白酶-3抗体（Caspase-3，货号ab32351）、兔抗凋亡相关因子（Fas，货号ab82419）、兔抗凋亡相关因子配体抗体（FasL，货号ab231011），鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体（GAPDH，货号ab8245）购自英国Abcam公司；
辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）标记的IgG山羊抗兔抗体（货号SA00001-2）、HRP标记的IgG山羊抗小鼠抗体（货号SA00001-1）购自中国proteintec公司；
大鼠白细胞介素（IL）-2/4/6/10酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒、谷胱甘肽硫转移酶（glutathione Stransferase，GST）活性检测试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性检测试剂盒及肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）检测试剂盒均购自索莱宝生物科技有限公司；
天狼猩红染料购自美国Santa cruz公司；
Masson染色试剂盒购自南京建成生物科技有限公司；
苏木精-伊红（HE）染色试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司；
EG1150H包埋机、RM2235切片机，DM2500光学显微镜（含偏光镜）购自德国Leica公司；
小动物手术器械购自上海医疗器械有限公司手术器械厂；
小动物呼吸机购自上海奥尔特电子有限公司，小动物超声诊断仪购自美国通用公司；
MP150多道生理记录仪购自美国BIOPAC公司；
酶标仪购自美国BIO-RAD公司。

1.2 研究方法

1.2.1 大鼠分组及喂养60只大鼠按随机数字表法均分为对照（Control）组、模型组及ARNI组，每组20只。Control组：假手术对照组，术中进行心脏视野暴露，但不结扎冠脉。ARNI组：建立心衰模型，每日灌胃沙库巴曲缬沙坦68 mg/kg（生理盐水稀释），连续干预3月。模型组：建立心衰模型，每日灌胃等体积生理盐水。沙库巴曲缬沙坦干预剂量参考von Lueder等［16］研究。

1.2.2 动物模型构建 大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液（按48 mg/kg剂量）进行麻醉。胸部备皮，将针形电极刺入大鼠四肢及胸壁皮下，连接超声心电图机，记录心电图。于左侧第4肋间开胸，钝性分离胸部肌肉，暴露肋骨，钝性分离肋骨间肌肉组织，眼科镊撕开心包膜，于左冠状动脉前降支起点2 mm处用6-0缝线结扎。心脏表面给予利多卡因注射液0.1 mL以预防室性心律失常的发生，重置心脏于胸腔，分层缝合胸壁。术后心电图表现为ST段抬高或出现病理性Q波判定为发生心肌梗死。术后3个月复查心脏超声，检测大鼠左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）并计算心脏指数（CI）；
以LVEF≤0.6或CI≤180 mL/（min·kg）作为心衰成功造模的标准。

1.2.3 彩色多普勒超声检查心功能 从每组中随机抽签法抽取5只大鼠，麻醉后予以仰卧位固定，胸部备皮，用线阵探头（频率9 MHz）对大鼠进行心功能检查。探头置于其左胸，在取得满意的胸骨旁左心室长轴二维图像后，在乳头肌水平将M型取样线垂直于室间隔和左心室后壁获得M型超声心动图，测定左心室质量（LV Mass）、左心室舒张末期内径（left ventricular end diastolic dimension，LVEDD）、左心室收缩末期内径（left ventricular end systolic dimension，LVESD）、左心室舒张末期容积（left ventricular end-diastolic volume，LVEDV）。计算LVEF及左心室短轴缩短分数（left ventricular fraction shortening，LVFS）。计算连续3个心动周期的平均值为最终数值，超声检查的操作及分析均由专人完成。

1.2.4 大鼠心脏病理变化 从每组中随机抽签法抽取5只大鼠，2%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉后，开胸分离心脏标本，用4%多聚甲醛固定24 h。将组织放入包埋盒中，流水冲洗30 min。组织依次放入70%、80%、90%、95%及无水乙醇中脱水处理，再置于二甲苯中透明1 min，后浸蜡1～2 min包埋，切成5µm厚的切片。分别用HE染色、Masson染色、天狼猩红染色进行组织学分析。

1.2.5 氧化应激指标和血浆炎性因子指标的检测 从每组中随机抽取5只大鼠，通过腹主动脉穿刺采集大鼠血液2 mL于肝素抗凝离心管中，3 000 r/min离心10 min，收集血浆。根据试剂盒说明书，采用酶标仪分别检测SOD和GST催化底物反应，检测SOD和GST的活性。根据试剂盒说明书，采用ELISA法检测血浆TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6和IL-10水平。

1.2.6 Western blot检测Bax、Bcl-2、Caspase-3、Fas和FasL蛋白的表达 从每组中随机抽签法抽取5只大鼠，处死后取适量心肌组织，钢珠磁力研磨，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA组织裂解液，BCA法进行蛋白定量。提取的蛋白进行SDSPAGE电泳进行分离，置于转膜液中，转膜至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，5%脱脂奶粉进行封闭2 h。将Bax、Bcl-2、Caspase-3、Fas、FasL和GAPDH抗体按1∶1 000比例稀释后，放入PVDF膜并置于4℃冰箱过夜孵育。次日，洗膜后加入山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗（1∶3 000）孵育2 h，洗膜3次，每次5～10 min。加入发光液，于GE公司的AI6300超灵敏多功能成像仪进行蛋白成像检测。使用Image J软件对图片进行灰度值计算。

1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t法，组内治疗前后比较采用配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 心衰模型的构建成功判定Control组与手术组（模型组与ARNI组）的术前心电图未见明显区别（图1A、B）。术后Control组的心电图较术前未见明显变化（图1C），手术组的心电图的ST段可见明显抬高（图1D），提示造模成功。术后3个月内Control组死亡1只，模型组死亡10只，ARNI组死亡4只。术后3个月复查心脏超声，相较于Control组（图1E），模型组（图1F）的心脏前壁运动幅度明显变差。ARNI组（图1G）的心脏前壁运动功能较模型组明显好转。

2.2 各组大鼠心脏超声相关指标比较（1）组内治疗前后比较。与术前比较，Control组术后3个月的LVEF、LVFS、LV mass、LVEDV、LVEDD和LVESD差异无统计学意义；
模型组和ARNI组术后的LVEF和LVFS下降，LV mass和LVEDV、LVEDD、LVESD均增加（P＜0.05），见表1。（2）组间比较。术前各组各指标差异无统计学意义，且术后各组LV mass差异亦无统计学意义。术后，与Control组比较，模型组LVEF和LVFS下降，LVEDV、LVEDD和LVESD增加（P＜0.05）；
与模型组比较，ARNI组LVEF和LVFS回升，LVEDV和LVESD下降（P＜0.05），但LVEDD差异无统计学意义，见表1。

2.3 各组大鼠心肌细胞变化比较 术后3个月，Control组心肌细胞完整、心肌纤维排列致密而整齐，形态呈圆柱状，长度均一，细胞外间质未见水肿及血管扩张，胶原分布均匀，相邻的胶原纤维网完好，胶原纤维较少；
模型组心肌细胞排列紊乱，心肌细胞核溶解，心肌纤维凝固性坏死，横纹消失，可见片状坏死，存活的心肌组织被分隔成岛状，散在分布，梗死区可见大量中性粒细胞浸润，心肌细胞大面积坏死被纤维结缔组织取代，大面积胶原纤维增生，且大量胶原纤维断裂，走形混乱，纤维化明显；
ARNI组的炎症细胞相比于模型组明显减少，且心肌细胞排列更为整齐，坏死范围明显缩小，胶原纤维增生明显减少，且纤维化程度较轻，见图2。

Fig.1 Comparison of ECG and echocardiogram changes before and after coronary ligation between the groups图1各组冠脉结扎前后心电图及心脏超声变化

Tab.1 Comparison of cardiac ultrasound related indexes between the three groups表1各组大鼠心脏超声相关指标比较 （n=5，±s）

Tab.1 Comparison of cardiac ultrasound related indexes between the three groups表1各组大鼠心脏超声相关指标比较 （n=5，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；
a与Control组比较，b与模型组比较，P＜0.05；
表2、3同。

组别Control组模型组ARNI组F LVEF术前0.79±0.04 0.77±0.03 0.77±0.02 0.698术后0.77±0.01 0.43±0.05a 0.58±0.02ab 172.041＊＊t 1.263 14.230＊＊14.900＊＊LVFS（%）术前49.16±3.95 47.06±2.56 47.32±2.32 0.716术后47.19±0.72 20.59±2.89a 33.91±2.40ab 181.427＊＊t 1.101 15.319＊＊8.981＊＊LV mass（mg）术前640.84±132.95 607.80±76.64 614.92±72.82 0.157术后797.28±117.85 1 001.42±257.98 812.41±165.47 1.800 t 1.969 3.270＊2.443＊组别Control组模型组ARNI组F LVEDV（µL）术前236.88±48.37 214.15±25.88 223.87±38.36 0.435术后266.41±48.40 348.00±41.52a 309.02±21.88b 5.495＊t 0.965 6.117＊＊4.311＊＊LVEDD（mm）术前6.50±0.69 6.23±0.32 6.30±0.62 0.300术后7.09±0.56 8.03±0.66a 7.75±0.24 4.357＊t 1.505 5.508＊＊4.868＊＊LVESD（mm）术前3.36±0.42 3.20±0.25 3.44±0.25 0.755术后3.91±0.41 6.20±0.26a 4.81±0.72ab 26.952＊＊t 2.107 18.511＊＊4.034＊＊

Fig.2 Comparison of HE staining，Masson staining and Sirius red staining of myocardial tissue between the three groups(×400)图2各组心肌组织HE染色、Masson染色及天狼星红染色对比情况（×400）

2.4 各组大鼠氧化应激和炎性因子比较 与Control组比较，模型组IL-2、IL-6和TNF-α水平升高，而SOD、GST和IL-10水平降低（P＜0.05）。与模型组比较，ARNI组可大幅度下调IL-2、IL-6和TNFα水平，上调GST、IL-4和IL-10水平（P＜0.05），SOD差异无统计学意义，见表2。

2.5 各组大鼠凋亡相关蛋白表达比较 与Control组比较，模型组Bax、Caspase-3、Fas和FasL蛋白表达水平增加，Bcl-2蛋白表达水平降低（P＜0.05）。与模型组比较，ARNI组Fas和FasL表达水平降低，Bcl-2的表达量增加（P＜0.05），但Bax和Caspase-3蛋白表达水平差异无统计学意义，见图3、表3。

Tab.2 Comparison of oxidative stress and inflammatory factors between the three groups表2各组大鼠氧化应激和炎性因子比较（n=5，±s）

Tab.2 Comparison of oxidative stress and inflammatory factors between the three groups表2各组大鼠氧化应激和炎性因子比较（n=5，±s）

组别Control组模型组ARNI组F SOD（U/mL）38.72±10.26 26.74±1.98a 36.18±6.50 3.944＊GST（U/mL）0.06±0.02 0.02±0.01a 0.06±0.02b 6.522＊IL-2（ng/L）39.80±8.32 56.40±5.83a 25.29±2.48ab 33.226＊＊组别Control组模型组ARNI组F IL-6（ng/L）39.33±9.23 104.41±4.53a 46.03±5.06b 146.362＊＊TNF-α（ng/L）115.47±4.93 147.80±2.04a 117.18±2.72b 138.611＊＊IL-4（ng/L）19.74±1.82 18.63±1.51 33.48±2.29ab 94.680＊＊IL-10（ng/L）20.28±4.15 12.17±2.76a 26.46±2.98ab 22.819＊＊

Fig.3 The expression levels of Bax,Bcl-2,Caspase-3,Fas and FasL proteins in rat cardiac tissue detected by Western blot assay图3大鼠心肌组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Fas和FasL蛋白表达的Western blot图

Tab.3 Comparison of apoptosis associated proteins between the three groups表3各组大鼠心肌组织凋亡相关蛋白相对表达量比较（n=5，±s）

Tab.3 Comparison of apoptosis associated proteins between the three groups表3各组大鼠心肌组织凋亡相关蛋白相对表达量比较（n=5，±s）

组别Control组模型组ARNI组F Bax 1.00±0.10 1.48±0.13a 1.30±0.15a 10.336＊Bcl-2 1.00±0.11 0.77±0.11a 1.13±0.12b 7.618＊Caspase-3 1.00±0.14 1.85±0.21a 1.52±0.35a 9.083＊Fas 1.00±0.08 1.76±0.23a 1.19±0.17b 15.503＊FasL 1.00±0.04 1.47±0.08a 0.85±0.08ab 67.087＊＊

心衰为各种心脏疾病的严重和终末阶段，发病率高，预后差，严重影响患者的生活质量，交感神经系统的过度激活造成心脏功能障碍，导致心肌细胞受损、心肌纤维化及左心室功能障碍［17-18］。PARADIGM-HF研究［19］显示，沙库巴曲缬沙坦可提高心衰患者运动耐量，降低猝死率、因心力衰竭再住院风险率和全因死亡率。另外，沙库巴曲缬沙坦还能使心脏负荷和心肌损伤相关的心脏生物标志物-脑利钠肽前体（NT-proBNP）和肌钙蛋白水平降低［20］。ENTRESTO-SAS研究［15］显示，沙库巴曲缬沙坦可改善慢性心衰患者的预后，降低病死率。本研究结果显示，心肌梗死后心衰大鼠的LVEF和LVFS下降，加用沙库巴曲缬沙坦可以逆转心脏泵血功能的下降，表明沙库巴曲缬沙坦能够减少心肌梗死对心脏泵血功能的损害。心脏泵功能的维持有赖于心肌结构的完整性。有研究显示，心室重构是心衰发展的基本机制，其主要表现为心脏结构异常与功能障碍［21］。本研究发现，心肌梗死后心衰大鼠LVEDD、LVESD、LVEDV明显增大，提示左心室重构明显，而应用沙库巴曲缬沙坦可减轻心室重塑，证实沙库巴曲缬沙坦可以减少心肌重构，抑制心脏扩大。

心肌梗死后中性粒细胞和单核细胞大量聚集，而炎症反应以巨噬细胞浸润为主。活化的M1巨噬细胞以吞噬和降解方式清除坏死的细胞碎片，并分泌IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性细胞因子和基质金属蛋白酶等［20］。心肌受损后纤维结缔组织和胶原纤维增生对受损心肌组织的修复和心功能的维持有帮助，但其长期增生效应则导致心肌僵硬度逐步增加、心肌顺应性降低、心室收缩及舒张功能减退，并最终导致心室重构，引起心衰［22-23］。SOD是机体天然抗氧化系统组成成分之一，GST具有抗损伤、抗癌变的作用。本研究发现，心肌梗死后心衰大鼠的SOD、GST和抗炎因子IL-10水平较Control组下降，促炎因子IL-2、IL-6及TNF-α增多，而术后应用沙库巴曲缬沙坦可明显降低氧化应激以及促炎因子的水平；
病理学检查发现，心肌梗死后心衰大鼠的梗死区域的心肌细胞大量坏死，炎症细胞浸润，纤维结缔组织增生，胶原纤维网断裂，胶原纤维增生，应用沙库巴曲缬沙坦后可减少炎症细胞浸润和心肌细胞坏死范围以及心肌纤维化程度，提示沙库巴曲缬沙坦通过发挥抗炎抗氧化应激作用，减轻心肌细胞损伤和纤维化。

心肌细胞缺血缺氧可以诱发心肌细胞凋亡坏死，过度的心肌细胞凋亡将严重影响心脏的功能。目前，细胞凋亡主要由两条信号传导途径调控：外源性（Fas和其他TNFR超家族成员和配体）和内源性（线粒体相关）途径。外源性凋亡途径是由死亡配体触发的细胞表面死亡受体信号启动，死亡配体与死亡受体结合并传递信号，启动凋亡程序［24］。本研究发现，心肌梗死后心衰大鼠的心脏Bax、Caspase-3、Fas和FasL蛋白高表达，且抗凋亡蛋白Bcl-2水平下调，术后应用沙库巴曲缬沙坦可显著降低凋亡相关蛋白累积，上调Bcl-2蛋白表达，表明沙库巴曲缬沙坦可以通过介导Fas/FasL通路，调节心肌细胞凋亡相关蛋白表达，减轻心肌细胞凋亡，进而维持心肌细胞活性。

综上所述，沙库巴曲缬沙坦可以通过介导Fas/FasL通路，降低心肌细胞凋亡，减轻炎症和氧化应激反应，减少受损心肌的炎症细胞浸润，进而降低心肌纤维化以及心室重构，更好地维持左心室形态，保护左心室泵血功能。

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