基于网络药理学探讨黄芪治疗慢性肾脏病的分子机制*

张宝霞，陈小飞，陈文佳，丁海波，饶克瑯，章小稳

1.新余市中医院，江西 新余 338000；

2.深圳市宝安区中医院，广东 深圳 518133

随着我国经济的发展，人们的生活水平日益提高，居民日常作息也发生改变，主要疾病由营养不良转变为各类慢性疾病，且呈年轻化趋势[1]。既往研究显示，我国成年人慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)的发病率已超过10%，由此可推算，我国CKD患者已超1亿[2]。CKD的临床表现隐匿，许多患者没有症状(无症状性血尿和/或蛋白尿)或仅有非特异性症状(腰部酸胀感)，导致其诊断较为困难。晚期CKD除了发展为终末期肾功能衰竭需长期透析治疗外，还影响多个系统、器官的功能，包括但不限于眼底病变，凝血功能异常，代谢异常，消化、神经及血液等系统并发症，水、电解质代谢紊乱及酸碱平衡失调[3]。CKD发展至终末期肾脏病后，其治疗费成倍增加且无完全治愈方法，是世界各国共有的公共卫生问题[4]。

黄芪为豆科植物膜荚黄芪或蒙古黄芪的根，被列为本草上品，有“补药之长”之称，甘温，入脾、肺经，具有“逐五脏间恶血”“通调血脉、流行经络”等功效[5]。现代药理研究也证明，黄芪具有改善心血管、免疫调节、抗肿瘤、抗衰老等药理作用[6]。刘新祥教授、远方教授、吕冬梅教授等都认为，黄芪在肾脏病的治疗中起着至关重要的作用，且遣方用药中多以黄芪为主[7-9]。然而，现代医学对黄芪治疗慢性肾脏病仍然存在理解不清和认识模糊的现象，为了有效地将“黄芪”和“慢性肾脏病”融合起来，本文基于系统药理学研究，整合黄芪活性成分、潜在靶标、相关疾病以及药代动力学数据，构建系统水平上的药物-成分-疾病靶点-通路-疾病网络，从整体水平阐明中药靶标及其作用机理。

1.1 黄芪活性成分及其对应靶点的筛选在中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)[10]中检索黄芪中的化合物，并按照药代动力学参数中的2个属性值——口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%及类药性(drug-likeness，DL)≥0.18进行活性成分初步筛选，获得有效活性成分化合物及其相关作用靶点。将获得的蛋白质靶点导入UniProt数据库(https：//www.uniprot.org/)对其名称进行校正；
若UniProt中未检索到相关名称，则在DrugBank Online数据库(https：//go.drugbank.com/)中检索其别称，再利用UniProt数据库对其别称进行校正。校正结束后舍去重复靶点及无对应靶点的蛋白质。

1.2 CKD靶点预测及黄芪治疗CKD的潜在靶点搜集在GeneCards数据库(https：//www.genecards.org/)检索疾病关键词“chronic kidney disease”，获得CKD相关疾病靶点，并在DrugBank Online数据库补充治疗慢性肾脏病的西药作用靶点。将黄芪活性成分相关靶点与CKD相关靶点导入Venny 2.1.0(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，取交集靶点，即为黄芪治疗CKD的潜在靶点，并绘制韦恩图。

1.3 蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络构建将黄芪治疗CKD的潜在靶点导入String(https：//cn.string-db.org/)在线数据库绘制PPI网络，选择“Multiple proteins”并设定最小互相作用阈值>0.9，其余设置均为默认设置，隐藏游离节点，运行得到PPI网络图，结果以TSV格式文件导出。将结果导入CytoScape 3.9.1软件进行拓扑分析，计算度(degree)值，并以其中位数为界限筛选出黄芪治疗CKD的核心靶点。

1.4 核心靶点的基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信号通路富集分析利用Metascape数据库(https：//metascape.org/gp/index.html)[11]对黄芪治疗CKD的核心靶点进行GO功能富集分析和京都基因与基因组百科全书信号通路富集分析，GO功能富集分析涉及生物过程(biological process，BP)、细胞组分(cellular component，CC)及分子功能(molecular function，MF)。

1.5 “黄芪-活性成分-潜在靶点-信号通路-疾病”网络图利用Excel构建“黄芪-活性成分”“活性成分-潜在靶点”“疾病-潜在靶点”“潜在靶点-通路”文件，并将文件导入CytoScape 3.9.1软件，构建“黄芪-活性成分-潜在靶点-信号通路-疾病”网络图。

2.1 黄芪活性成分及其相关靶点基于TCMSP共搜集到黄芪有效成分20个及相关靶点204个，对应靶点数目排名前10位的有效成分为槲皮素(quercetin，148个靶点)、山柰酚(kaempferol，62个靶点)、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇(7-O-methylisomucronulatol，45个靶点)、刺芒柄花素(formononetin，39个靶点)、异鼠李素(isorhamnetin，37个靶点)、华良姜素(jaranol，24个靶点)、3，9-二-O-甲基尼森香豌豆紫檀酚(3，9-di-O-methylnissolin，23个靶点)、毛蕊异黄酮(calycosin，23个靶点)、白桦脂酸(mairin，13个靶点)、(6aR，11aR)-9，10-dimethoxy-6a，11a-dihydro-6H-benzofurano[3，2-c]chromen-3-ol(23个靶点)等，以上所有成分均经化源网(https：//www.chemsrc.com/)检索出中文名称。利用UniProt数据库检索出204个靶标对应的200个官方基因名(其中3个蛋白质在人类物种中缺乏，另一个蛋白在UniProt中未检索出官方名，故舍去4个靶标)。见表1。

表1 黄芪有效成分相关信息表

2.2 CKD靶点及黄芪治疗CKD的潜在靶点检索数据库得出CKD对应靶点13 955个，设定score值>20%，则筛选出对应靶点1 266个，将黄芪活性成分相关靶点与CKD对应靶点导入Venny2.1.0，得到黄芪治疗CKD的潜在靶点104个，涉及基质金属蛋白酶2(matrix metallopeptidase 2，MMP2)、凋亡调节因子Bcl-X(BCL2-like 1，BCL2L1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8(caspase 8，CASP8)、CASP9、组织蛋白酶D(cathepsin D，CTSD)、小窝蛋白1(caveolin 1，CAV1)、CD40 配体(CD40 ligand，CD40LG)、肿瘤蛋白p53(tumor protein p53，TP53)、Ⅲ型胶原蛋白α1(collagen type Ⅲ alpha 1，COL3A1)、C 反应性蛋白(C-reactive protein，CRP)等。见图1。

图1 黄芪活性成分相关靶点与CKD相关靶点韦恩图

2.3 PPI网络将104个黄芪治疗CKD的潜在靶点导入String在线数据库，获得PPI网络图，并利用CytoScape3.9.1软件进行分析。该PPI 网络图共有103个节点及2 067条边，degree平均值为40.14，以degree值中位数为界限筛选出53个核心作用靶点，其中degree值排名前10位的靶点分别为白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6，degree值88)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF，degree值87)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase 1，AKT1，degree值84)、IL-1β(degree值83)、TP53(degree值79)、MMP9(degree值77)、CASP3(degree值76)、前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase，PTGS2，degree值73)、JUN(degree值73)、IL-8(又称CXCL8，degree值72)，提示这些靶点可能是黄芪治疗慢性肾脏病的核心靶点。见图2。

图2 黄芪治疗CKD潜在靶点的PPI网络图

2.4 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析KEGG信号通路富集分析获得32条信号通路，主要涉及癌症通路(pathways in cancer)、脂质和动脉粥样硬化(lipids and atherosclerosis)、IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、前列腺癌(prostate cancer)、化学致癌-活性氧途径(chemical carcinogenesis-reactive oxygen species)、化学致癌-受体激活途径(chemical carcinogenesis-receptor activation)、疟疾(malaria)、小细胞肺癌(small cell lung cancer)、低氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)信号通路(HIF-1 signaling pathway)、癌症中的转录失调(transcriptional misregulation in cancer)等。根据校正后P值进行排序，选择前20条通路绘制柱状图。见图3。GO功能富集分析得到104个生物过程(biological process，BP)，104个细胞组分(cellular component，CC)及104个分子功能(molecular function，MF)，其中BP主要涉及对无机物的反应(response to inorganic substance)、对脂多糖的反应(response to lipopolysaccharide)、细胞迁移的正向调节(positive regulation of cell migration)、细胞死亡的正向调节(positive regulation of cell death)、腺体发育(gland development)、细胞黏附的调节(regulation of cell adhesion)等；
CC主要涉及膜筏(membrane raft)、细胞外基质(extracellular matrix)、转录调节复合物(transcription regulator complex)、囊泡腔(vesicle lumen)、丝氨酸型肽酶复合物(serine-type peptidase complex)、质膜外侧(external side of plasma membrane)、质膜蛋白复合物(plasma membrane protein complex)等；
MF主要涉及DNA结合转录因子结合(DNA-binding transcription factor binding)、细胞因子受体结合(cytokine receptor binding)、激酶结合(kinase binding)、蛋白质结构域特异性结合(protein domain specific binding)、蛋白酶结合(protease binding)、蛋白质同二聚化活性(protein homodimerization activity)、磷酸酶结合(phosphatase binding)、丝氨酸水解酶活性(serine hydrolase activity)、转录共调节子结合(transcriptional coregulator binding)等。将结果分别按照P值排序，选择前20条结果绘制柱状图。见图4、图5、图6。

图3 KEGG富集分析结果

图4 GO富集分析结果(生物过程)

图5 GO富集分析结果(细胞组分)

2.5 “黄芪-活性成分-潜在靶点-信号通路-疾病”网络图将黄芪、黄芪活性成分、疾病、潜在靶点、信号通路导入CytoScape3.9.1软件，构建“黄芪-活性成分-潜在靶点-信号通路-疾病”网络图。图中黄色圆形代表黄芪，绿色三角代表黄芪活性成分，蓝色四边形代表潜在靶点，红色V型代表信号通路，紫色六边形代表疾病。见图7。

图6 GO富集分析结果(分子功能)

图7 “黄芪-活性成分-潜在靶点-信号通路-疾病”网络图

既往文献总结黄芪的化学成分包括多糖类、皂苷类、黄酮类及氨基酸、微量元素、甾醇类等物质，其中黄酮类主要有效活性成分多达30余种，主要有槲皮素、异鼠李素、毛蕊异黄酮等，具有发挥清除自由基、调节免疫、抗病毒、抑制血管内皮单层通透性增加等作用[12]。张蔷等认为黄芪通过黄酮类成分发挥免疫调节、抗损伤、抗突变、抗肿瘤、抑制动脉粥样硬化等活性[13]。本文通过网络药理学方法预测到黄芪有效成分中对应靶标数目前10位的化合物分别为槲皮素(黄酮类)、山柰酚(黄酮醇类)、刺芒柄花素(异黄酮类)、异鼠李素(黄酮类)、华良姜素(黄酮醇类)、毛蕊异黄酮(黄酮类)、白桦脂酸(三萜类)等。综上可知，黄芪治疗慢性肾脏病的主要有效活性成分可能为黄酮类。

通过PPI网络发现，IL-6、TNF、AKT1、IL-1β、TP53、MMP9、CASP3、PTGS2、JUN、CXCL8可能是黄芪治疗慢性肾脏病的核心靶点。IL-6是在免疫、组织再生和新陈代谢中具有多种生物学功能的细胞因子，与IL-6受体结合后，进一步与信号亚基IL-6信号传导因子/糖蛋白130(IL-6 signal transducer/glycoprotein 130，IL-6ST/gp130)结合以触发细胞内IL-6信号通路。与膜结合的重组人IL-6受体(recombinant human IL-6 receptor，IL-6R)和 IL-6ST的相互作用刺激“经典信号”，通过诱导血管内皮生长因子(vascular endothlial growth factor，VEGF)直接或间接导致血管生成活性增加；
另外，IL-6可充当肌因子，在组织损伤期间起保护作用，是维持组织再生所必需的；
也可通过激活IL-6ST-YAP-NOTCH通路诱导上皮细胞再生[14]。TNF主要由巨噬细胞分泌，可诱导某些肿瘤细胞系细胞死亡，还是通过直接作用或刺激IL-1分泌而引起发热的强热原，并与恶病质的诱导有关，在某些条件下可刺激细胞增殖并诱导细胞分化[15]。AKT1是胞内磷脂酰肌醇3激酶(phosphoInositide-3 kinase，PI3K)下游的直接靶蛋白，可参与调节细胞增殖和代谢，促进纤维化相关基因转录和蛋白质合成[16]。此外AKT1激活可促进核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)激活，启动下游炎症反应，产生TNF-α、IL-6等炎性因子，加重细胞的纤维化[17]。进一步的研究表明，AKT是转化生长因子e-1(transforming growth factor e-1，TGFe-1)介导的生物过程的重要调节因子，可刺激Smad、mTOR等肾脏细胞调节转导系统，调节足细胞、系膜细胞、肾小管上皮细胞等多种细胞功能[18]。关键靶基因中IL-6、IL-1β均是经典的炎症因子，PTGS2调控炎症应答，是炎症反应的主要介质，通过引导中性粒细胞到达感染部位起到趋化因子的作用，两者在炎症反应中具有特殊作用[19]。CXCL8与CXC趋化因子受体结合可以促进中性粒细胞浸润并诱发组织炎症[20]，研究证实，阻断CXC趋化因子受体传导可以减轻小鼠的肾脏炎症和肾纤维化[21]。TNF、TP53与肿瘤密切相关，MMP9、CASP3参与细胞凋亡。而慢性肾脏病的发病及进展均与肾脏纤维化有关[22]，近年来，围绕肾纤维化发生的机制研究发现其与炎症、巨噬细胞转分化和促纤维化通路等的异常活化有关[23]，且慢性肾脏病终末期死亡原因中恶性肿瘤的死亡原因超过10%，排所有死亡原因的第3位[24]，与本次研究所涉及的靶点不谋而合。有研究同样也发现，黄芪可以从多个层面调节免疫系统，直接影响肿瘤细胞的增殖和凋亡，调节肿瘤细胞周期生长，也可以通过调节免疫系统间接改变肿瘤微环境，抑制肿瘤细胞的生长和迁移[25]。

GO生物过程分析可得，黄芪有效成分可通过作用于细胞的膜筏、细胞外基质、转录调节复合物、囊泡腔、质膜外侧、质膜蛋白复合物、细胞质核周区、髓鞘、轴突等部位，参与DNA结合转录因子结合、细胞因子受体结合、激酶结合、蛋白质结构域特异性结合、蛋白酶结合、磷酸酶结合等分子功能的调节，调控癌症中的转录失调、无机物及脂多糖的反应、凋亡信号通路、细胞迁徙及死亡的正向调节、上皮细胞及平滑肌细胞增殖、炎症反应等治疗慢性肾脏病。

本文预测了黄芪治疗慢性肾脏病的主要靶点，并对主要靶点进行KEGG及GO分析，结果表明，黄芪可能通过抗感染、抑制纤维化、调控细胞凋亡等信号通路治疗慢性肾脏病。

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