B(A)亚型一家系的血清学及分子遗传学分析
时间：2023-05-29 19:45:14 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
刘爱萍,宋 婕，王书亚，孔永奎，吕先萍
郑州大学第一附属医院输血科 郑州 450052
输血相容性检测中ABO血型正反定型不符是最常遇到的血型鉴定困难，这通常与患者的病理性疾病状态、药物或者遗传因素等密切相关，前两者伴随疾病的发生发展或者用药的变化而有所改变，后者则常见于ABO亚型[1]。B(A)亚型是一种比较罕见的ABO亚型，目前报道的B(A)亚型共有6种[2]，通常认为B(A)亚型等位基因是在正常B.01等位基因的基础上发生单碱基突变形成的，其表达产物除了具有较高的B糖基转移酶活性外，还具有少量的A糖基转移酶活性[3]。在血清学上一般表现为较强的B抗原和很弱的A抗原，血清中含有抗A抗体，但具体到不同个体，可能出现一定的差异性[4]。本研究通过对1例B(A)亚型的鉴定、家系分析及交叉配血试验，探讨其血清学及分子遗传学特征，分析其合理的临床输血策略。
1.1 病例资料患者(先证者)，男，56岁，因腰椎间盘突出拟行手术治疗在输血科进行手术前备血，ABO血型血清学检测发现正反定型不一致需要进一步鉴定。患者无输血史，无家族遗传性疾病史，无血液系统疾病史，无近期感染。采集其父母、兄弟姐妹、妻子及儿女血标本进行ABO血型血清学及分子生物学检测，所有家族成员均知情同意。
1.2 主要试剂和仪器单克隆抗A、抗B(长春博德生物公司)，ABO血型反定型试剂盒(长春博迅生物公司)，抗A1、抗H(荷兰Sanquin公司)，抗AB(上海血液生物医药公司，批号20200128)，人源抗A、抗B选择正常献血员血清，测定效价为128，凝聚胺试剂盒(珠海贝索生物技术有限公司)，SanPrep柱式DNA凝胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)，血型血清学离心机(日本久保田)，PCR仪、3730XL测序仪(美国ABI公司)。
1.3 ABO血型血清学检测采用试管法进行血型血清学检测，血型血清学操作及结果判定参照《AABB技术手册》[5]。
1.4 ABO基因的扩增和测序采用上海生工生物工程技术服务有限公司的血液基因组DNA抽提试剂盒提取被检者全血DNA。参照文献[6]建立的方法扩增ABO基因第6、7外显子，ABO基因第6外显子引物序列为：上游5’-TGGAAGGGTGGTCAGAG GA-3’，下游5’-CTGGAGAAGGAGCTGGGTT-3’，目的扩增片段长度为479 bp。ABO基因第7外显子引物序列为：上游5’-TGGGAAGAGGATGAAGT GAAT-3’，下游5’-CAACAGGACGGACAAAGGA-3’，目的扩增片段长度为975 bp。PCR扩增及测序引物均由上海生工生物技术服务有限公司合成。取5 μL扩增后PCR产物加入100 g/L琼脂糖凝胶中，150 V、100 mA电泳10～20 min，紫外透射仪下确定PCR扩增是否成功。参照DNA凝胶回收试剂盒说明书纯化回收PCR扩增产物，并以此作为测序模板，使用测序仪进行测序。
1.5 序列分析及比对使用Chromas软件查看测序图谱，DNAMAN软件进行DNA测序结果的拼接和比对，与dbRBC等位基因数据库中A1.01基因序列进行比对，确定被检者基因型，ABO等位基因的命名方法参照ISBT血型抗原等位基因数据库。
1.6 吸收放散试验将BA.02等位基因携带者的红细胞分别与人源抗A进行吸收放散试验，鉴定红细胞上弱A抗原，吸收放散试验操作及结果判定参照《AABB技术手册》[5]。
1.7 交叉配血试验通过盐水法及凝聚胺法将BA.02等位基因携带者的血标本分别与A、B、O及AB型献血者悬浮红细胞制品进行交叉配血试验，交叉配血试验操作及结果判定参照《AABB技术手册》[5]。
2.1 血型血清学检测ABO血型血清学结果(表1)显示先证者、父亲、姐姐及其女儿正反定型不符，表现为AwB或者B(A)亚型，其哥哥、妻子及儿子均为O型，母亲为A型，妹妹为AB型。
表1 ABO血型血清学检测结果
2.2 ABO基因测序结果及碱基比对参照dbRBC等位基因数据库，以A1.01参比序列进行碱基差异比对，发现先证者第6外显子区存在c．261delG及c.297A>G杂合突变，第7外显子区存在c.526C>G、c.646T>A、c.657C>T、c.681G>A、c.700C>G、c.703G>A、c.771C>T、c.796C>A、c.803G>C、c.829G>A及c.930G>A杂合突变，见图1。
图1 先证者第7外显子杂合突变
除c.700C>G外，其余突变是A1.01基因、B.01基因和O.01.02基因的区别所在，结合单倍型分析先证者一条单倍型基因为O.01.02，另一条单倍型基因为BA.02，其基因型ABO*BA.02/O.01.02。与B.01比对，BA.02存在c.700C>G突变，提示BA.02基因的是在B.01基因的基础上发生了点突变，造成其编码蛋白第234位的脯氨酸(Pro，P)被丙氨酸(Ala，A)替代。
2.3 家系分析先证者及家庭成员ABO基因第6、7外显子测序分析结果显示，先证者、父亲、姐姐、妹妹和女儿在第7外显子上发生c.700C>G杂合突变，符合BA.02等位基因特征，结合单倍型分析先证者及家庭成员基因型分别为：先证者BA.02/O.01.02，姐姐BA.02/O.01.02，父亲BA.02/O.01.01，女儿BA.02/O.01.01，妹妹BA.02/A1.01，母亲A1.01/O.01.02，哥哥和儿子O.01.01/O.01.02，妻子O.01.01/O.01.01。家系分析显示BA.02等位基因从父亲遗传至先证者再到女儿而非自然突变，呈现稳定遗传，见图2。
Ⅰ～Ⅲ：家系代数；
□：正常男性；
■：BA.02等位基因携带男性；
○：正常女性；
●：BA.02等位基因携带女性；
黑色箭头指向先证者
2.4 吸收放散试验结果BA.02等位基因携带者的红细胞吸收放散试验结果显示先证者、父亲、姐姐和女儿红细胞吸收后的人源血清抗A效价由原来的128分别降为16、32、16和16，其吸收后红细胞末次洗涤液与Ac、Oc均不凝集，放散液与Ac凝集，与Oc不凝集，说明3位被检者红细胞上含有A抗原。
2.5 交叉配血结果先证者、父亲、姐姐和女儿血标本，分别与B型或O型悬浮红细胞进行交叉配血主侧均相合，次侧均不相合；
与A型悬浮红细胞进行交叉配血主次侧均不相合；
与AB型悬浮红细胞进行交叉配血主侧均不相合，次侧均相合；
先证者血标本与父亲、姐姐或者女儿血标本进行交叉配血主次侧均相合，具体交叉配血结果见表2。
准确的ABO血型鉴定对于输血安全十分重要，而B(A)亚型相对罕见，其血清学表现又存在一定的个体差异，仅靠血清学检测不能进行准确的血型鉴定。分子生物学的发展和应用，揭示了B(A)亚型的发生是由于ABO基因发生突变[7]，这种突变常在家系调查中呈现一定的遗传特征。因此，在血清学鉴定困难时，可以结合基因测序和家系调查分析为ABO血型的准确鉴定保驾护航[4]。
B(A)亚型典型的血清学特征为“弱A强B”，与抗H凝集增强，血清中含有抗A。马会敏等[8]发现当单克隆抗A效价为256时，其检测的6例B(A)亚型标本红细胞仅1例出现凝集反应。本研究中所用的人源抗A效价为128，结果显示仅先证者姐姐和女儿红细胞与其呈现出较弱的阳性反应，这说明B(A)亚型个体间A抗原的表达强弱具有一定的差别。付丽辉等[9]在进行家系调查时发现先证者母亲、大姨、小姨及舅父表型均为B型，而基因型均为BA.04/B.01，这可能是因为B.01基因增加了B糖基转移酶的活性，竞争抑制了少量A糖基转移酶对共同受体物质的作用，使BA基因携带者红细胞上A抗原的表达量不足以被现有的某些单克隆抗A试剂检测出。与之相反，本研究结果显示先证者妹妹表型为AB型，而其基因型为BA.02/A1.01，这可能是A1.01基因对A糖基转移酶的协同增强作用掩盖了BA.02基因导致的少量A糖基转移酶活性，血清学表现为正常的AB型。因此，在BA基因和A基因或者B基因共同遗传时，B(A)表型可能被A抗原或者B抗原掩盖。因此，在实际临床工作中，B(A)亚型可能由于A抗原的表达强弱不同，人源抗A的效价差别以及个体间的基因型差异等，血清学反应呈现出较大差别。
当血清学鉴定困难时，结合基因测序和家系分析可以为准确的血型鉴定提供帮助。本例先证者血清学表现符合AwB或B(A)亚型，为明确其血型进行基因测序分析，结果显示其ABO基因第7外显子在B.01基因的基础上发生c.700C>G杂合突变，基因型结果为BA.02/O.01.02；
进一步家系调查发现，BA.02等位基因从父亲遗传至先证者再到女儿而非自然突变，呈现稳定的顺式遗传。B.01基因上第7外显子700位的C>G单碱基突变，造成其编码蛋白第234位的脯氨酸被丙氨酸替代。脯氨酸是杂环氨基酸，含有一个吡咯环，突变为丙氨酸后造成吡咯环位置的C-γ原子缺失，C-γ原子的缺失会影响266位甲硫氨酸(Met)侧链的方向[10]。邱丽等[11]通过建立半乳糖基转移酶(GTB)空间模型分析发现，P234A突变，使其与Met266位侧链之间的范德华力消失，导致Met266位和Ala268位形成的供糖体结合凹槽的空间结构发生改变，从而可以容纳较大的UDP-GalNAc(尿苷二磷酸-N-乙酰半乳糖胺，A抗原糖供体)的N-乙酰基，使突变的GTB可以转移少部分UDP-GalNAc到底物H抗原上，形成双功能酶活性，在红细胞膜上表达相对正常的B抗原和较弱的A抗原。
在ABO亚型的研究中，相继有学者发现其血清学表现和基因检测结果存在异质性，即血清学表现相似的个体，基因突变可能存在一定差异，而有些基因检测存在相同突变的个体，血清学表现又出现一定的不同[12-13]。血清学检测是发现亚型的基础，而基因测序分析可以避免抗原、抗体的改变对血型鉴定的干扰，两者相结合可以为准确的血型鉴定提供有力的保证。在临床输血时，B(A)亚型多推荐同型输血或者相容性输血，但由于B(A)亚型比较罕见，同型输血一般难以实现，在非急诊用血的患者可以考虑自体输血。而对于急诊或不适合自体输血的患者可以选择B型或O型洗涤红细胞和AB型血浆、冷沉淀、血小板进行配合性输血。本研究先证者术前血红蛋白正常，术中出血量较少，没有输注血液制品。B(A)亚型如果作为献血者供给正常血型患者，容易出现交叉配血不合，可以作为稀有血型献血者登记建库，同时提供稀有血型温馨提示信息，避免以后延误诊疗用血，为患者节省宝贵的临床救治时间。
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