FGF2的生物信息学分析及其在低氧神经保护中的作用研究*
时间：2023-05-29 16:25:18 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
曹晓宇，杨海霞，靳庆玲，谢 伟，2，邵 国，鲍牧兰，2，巴德仁贵,2
(1.包头医学院内蒙古自治区低氧转化医学重点实验室，内蒙古包头 014040；
2.包头医学院医学技术与麻醉学院神经生物学教研室)
缺血/低氧是临床医学常见的基本病理过程和死因，也是航天、高原、深水等特殊环境所面临的基本问题。缺血/低氧导致脑损伤的分子机制主要包括缺氧加重组织炎症反应释放细胞毒性物质来损伤脑组织及细胞能量代谢障碍加重脑组织细胞坏死，但内源性的防护机制可以提高细胞和组织对缺血/低氧的耐受[1]。缺血/低氧预适应(Ischemia/Hypoxia Preconditioning，I/HPC)是动员细胞和组织对缺血/低氧耐受的一种有效手段。I/HPC被认为是细胞内源性防护机制的启动，这种防护机制一般通过预先给机体一个温和的(亚致死性)缺血/低氧刺激，可以增强机体对随后更严重的(致死性)缺血/低氧刺激的耐受力[2]。
成纤维生长因子(Fibroblast growth factor，FGF)是一种在神经系统中广泛表达的促有丝分裂原，对中枢神经系统的生长、发育及损伤修复具有重要意义[3-5]。特别是在缺血/低氧刺激脑损伤后，内源性的FGF能够刺激海马神经前体神经母细胞分化，起到保护脑神经的作用[6,7]。通常FGFs以家族的形式存在，作为细胞间信号分子在胚胎发生和分化过程中发挥作用[8]。目前，在人体内鉴定出23个FGFs家族成员，其中FGF15尚未证实，多数FGFs(FGF3-8、10、15、17-19、21-23)的N末端具有典型的信号序列分泌蛋白。
有研究表明，癫痫或缺血性脑损伤后内源性FGF2对脑海马组织的空间结构、语境记忆及神经元再生具有重要的作用，特别是脑损伤后内源性的FGF2的合成能够刺激海马神经前体神经母细胞分化，起到保护脑神经的作用[9,10]。同样，Graham等研究发现，FGF2在幼年大鼠的学习与记忆功能发展过程中起促进作用，同时有助于成年个体恢复受损的认知功能[11]。虽然I/HPC及FGF均可以对组织产生保护作用，但是其确切的分子机制尚无定论，总体概括起来是降低能耗/增加供能和抑制死亡/促进生存，而这些保护性分子如何被调动和参与其中是个值得研究的问题。
1.1实验材料 HT22细胞(小鼠海马神经元细胞)(北京协和细胞中心)。
1.2数据处理及生物信息学分析
1.2.1数据的搜索与获得 从MGI(Mouse Genome Informatics，http://www.informatics.jax.org)、UNIPROT (http://www.uniprot.org/)、NCBI (National Center for Biotechnology Information，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等数据库中搜索FGF基因家族成员，并利用UCSC genome browser 在线Blat分析软件(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat)作为补充对比数据。为了保证序列比对的可靠性，分别选取了人(Homo sapiens)的FGF1(NP_000791.1，NM_000800.4 )和小鼠(Mus musculus)的FGF1(NP_034327.1，NM_010197.3)的序列作为标准查询序列，利用SMART在线工具(http://smart.embl-heidelberg.de/)和CD-search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ cdd/wrpsb.cgi)分析鉴定候选蛋白的FGF结构域。将鉴定出FGF2基因家族成员作后续生物信息学分析。
1.2.2FGFs基因家族成员的鉴定 从MGI、UNIPROT、NCBI三大数据库中搜索FGF基因家族成员，以小鼠(Mus musculus)的FGF1(NP_034327.1，NM_010197.3)的氨基酸序列作为标准探针序列，同时建立本地BLAST文库进行数据搜索作为补充数据。使用SMART和CD search在线工具分析鉴定候选蛋白的FGF结构域，利用MEGA6(http://www. megasoftware.net)软件中的Clustal W程序对该蛋白家族的氨基酸残基进行多序列联配，其他参数为默认值。将比对序列结果使用邻位相接法(Neighbor-Joining，NJ)进行系统发生树的构建，其参数设置为：自举法分析(bootstrap analysis)进行1 000次重复，代替模型(substitution model)为泊松分布，差异/缺失数据处理(gap/missing data treatment)为完全删除等。分析进化树每个节点上自举值得期望值，同时使用最大简约法(Maximum Parsimony，MP)作为优化方案并验证NJ法构建的系统发生树的可靠性。应用CLC Sequence Viewer 6.8软件构建FGF家族蛋白序列比对。参数设置：序列分布(sequence layout)；
Spacing设为10个氨基酸残基；
fixed wrap设为70氨基酸残基，注释分布选择默认值，Residue Coloring设为含有背景颜色；
Consensus设为选择隐藏；
Graph设为选择隐藏，其他参数选择默认值。
1.3建立HT22细胞低氧模型 经复苏培养后选取状态良好的细胞，分为空白对照组(C)、低氧组(H)及低氧预适应组(HPC)。设置低氧预适应组条件，低氧(1 % O2/5 % CO2/ 94 % N2)30 min和常氧(21 % O2/ 5 % CO2/ 75 % N2)30 min循环交替进行，共4个循环，后急性低氧13 h，复氧6 h；
低氧组则为直接低氧刺激13 h，复氧6 h。空白对照组不进行任何处理，完成模型后收集各组细胞。
1.4细胞中FGF2 mRNA的qRT-PCR检测 使用Trizol提取法，按照说明书步骤提取各组细胞总RNA，使用Thermo反转录试剂盒，取3 μg总RNA用于cDNA第一链合成，对FGF2及β-actin基因进行qRT-PCR检测。
1.5细胞中FGF2蛋白表达变化检测 向细胞沉淀中加入100 μL RIPA裂解液和1 μL蛋白酶/磷酸酶抑制剂，振荡混匀，4 ℃ 12 000 rpm离心15 min，收集上清液为蛋白悬液。使用Thermo BCA蛋白定量试剂盒，根据说明书测定每个样品的蛋白浓度。在12 % SDS-PAGE凝胶上电泳分离蛋白后，将蛋白质转印到PVDF膜上。将膜封闭在5%的脱脂牛奶中以35 rpm/min室温封闭1.5 h，使用1×TBST洗膜10 min，共3次。使用抗FGF2一抗(1∶1000稀释，Santa)，抗β-actin一抗(1∶1000稀释，Santa)于4 ℃条件下孵育PVDF过夜，1×TBST洗膜3次，每次10 min。室温下用辣根过氧化物酶标记的驴抗兔和山羊抗小鼠抗体孵育1.5 h，1×TBST洗膜10 min，共3次，然后使用ECL超敏发光液覆盖在PVDF膜上，放入化学发光仪曝光，检测抗体的表达。
1.6统计分析 所有实验均重复三次或以上，实验数据取各组平均值，使用SPSS软件进行数据分析，以(均数±标准差)表示，使用单因素方差分析(ANOVA)来比较多组数据间差异，两组间数据比较使用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2.1FGF家族系统进化树构建及保守序列分析 系统进化树法是一种亲缘分支分类方法。为了研究家族基因之间的进化关系，采用MEGA6软件中距离依靠法(distance methods)中的NJ方法对人源FGF1-FGF23和鼠源FGF1-FGF23基因构建系统进化树(图1)。分析结果表明，FGFs家族又分为7个亚家族(即：FGF1、FGF4、FGF7、FGF8、FGF9、FGF11、FGF15/19)，每个亚家族含有2～4个成员，FGF每个亚家族自举法的期望值较高，人源和鼠源FGF基因在进化上同源性较高，聚为一类。其中FGF15/19亚家族中除了FGF22、FGF23分别对应并聚类在一个进化分支上，鼠源FGF15与人源FGF19聚类在一个进化分支上。
2.2FGF家族保守序列分析 以FGF蛋白为查询序列，CD search在线工具分析鉴定FGF结构域，同时通过CLC Sequence Viewer 6.8软件对序列进行比对，本文只列出具有典型FGF家族结构域的FGF1和FGF2进行系统分析(图2)。FGF1含有一个由16个氨基酸组成的FGF受体结合域(Y-x31-S-x-E-x-A-x27-P-x7-E-x2-EENHYN-x-Y-x33-L-x-L-x-L)，而FGF2含有一个由17个氨基酸组成的FGF受体结合域(K-x2-Y-x31-Q-x-E-x-R-x27-V-x7-E-x2-ESNNYN-x-Y-x31-L-x- L-x-M)。虽然FGF家族典型结构域部分氨基酸不同，有多个保守的基序组成，但不同FGF家族成员能够与特定的FGF受体结合进行信号的转导。FGF家族成员含有肝素结合区域。肝素结合位点是由富含赖氨酸和精氨酸结构域(KK-K-R-K)组成，肝素与FGF-FGFR复合物的FGFR-1接触，促进FGFR二聚化，通过调控FGF的活性进而调控信号转导，促进细胞的增殖和分裂。
图2 FGF蛋白保守结构域预测和序列比对
2.3低氧和低氧预适应对FGF2 mRNA表达水平的调控 基于生物信息学研究结果分析，结合前期实验对FGF家族成员在大脑皮层和海马区的表达谱分析，FGF2的功能研究具有重要意义，因此本研究通过细胞实验进一步检测FGF2在低氧及低氧预适应条件下的表达情况，进而探讨其功能特点。结果如图3所示，相比于C组，H组和HPC组FGF2 mRNA表达水平均有所下降(P<0.05)，而与H组相比，HPC组FGF2 mRNA表达水平有所升高(P<0.05)。结果显示，低氧刺激和低氧预适应均降低了FGF2在mRNA水平的表达，而低氧预适应相比于低氧刺激FGF2 mRNA表达有所升高，表明低氧预适应的神经保护作用可能与FGF2的差异表达有关。
图3 各组HT22细胞中FGF2 mRNA表达水平
2.4低氧和低氧预适应对FGF2蛋白表达水平的调控 结果如图4所示，相比于C组，H组和HPC组FGF2蛋白水平表达均有所下降(P<0.05)，而与H组相比，HPC组FGF2蛋白水平表达有所升高(P<0.05)。结果显示，低氧刺激和低氧预适应均降低FGF2在蛋白水平的表达，而低氧预适应相比于低氧刺激FGF2表达有所升高，表明FGF2可能参与低氧耐受神经保护作用。
图4 各组FGF2蛋白表达水平
提高神经细胞对缺氧的耐受性可减轻缺血/缺氧所引起的脑部疾病(如缺血性脑卒中)的症状[12,13]。低氧预适应作为机体的内源性保护机制，通过间断性低氧刺激手段可以有效地预防这一疾病的发生。有研究表明，在这一保护过程中多种相关基因在mRNA以及蛋白水平均发生明显的变化，进而影响机体的学习记忆能力[14-16]。
生物信息学方法与传统的基于实验室生物学研究相比，可以用较低的成本和较快的时间获得研究线索。通过对家族蛋白的系统进化关系、理化性质、蛋白质功能域的预测和分析，发现新规律、新信息，为进一步的实验研究提供思路和切入点[17-19]。
新生血管的生成对缺血性脑血管疾病的治疗是目前国内外研究的热点。FGF2是纤维细胞生长因子家族成员之一，是最早发现的血管生成因子之一，其在体内、体外具有促使细胞迁移和血管生成等作用[20,21]。缺血性卒中后，FGF2可能上调中枢神经系统周细胞中PDGFRβ的表达，通过与PDGF-BB的相互作用激活周细胞的功能，有助于神经保护和血管生成，表明FGF2是治疗脑缺血的潜在靶基因[22]。此外，研究表明，敲除FGF2明显增加小鼠脑梗死体积并且影响BDNF和NF-κB表达的水平，揭示内源性FGF2在缺血性脑损伤中具有重要的神经保护作用[23]。本研究探索FGF2是否参与低氧耐受神经保护过程。本研究提取了各组小鼠海马神经元细胞(HT22)中的总蛋白和RNA，通过WB和qPCR的方法检测FGF2的表达变化。研究发现，相比于对照组，低氧与低氧预适应处理均下调了FGF2表达，但低氧预适应组相比于低氧组，FGF2的表达有所上调，揭示低氧预适应作为细胞内源性防护机制的启动，通过触发多种机制来诱导其神经保护作用，例如增强血管调节，通过上调与血管生成相关基因的表达(如FGF2的表达)，以此增强机体对之后更严重的低氧/缺血刺激的耐受性。虽然本研究表明FGF2可能参与低氧预适应的神经保护作用，但FGF及其家族成员的种类及功能十分复杂，因此FGF2参与神经保护的相关信号通路还需要深入探索。本研究旨在为缺血/低氧相关疾病的发生和发展机制提供新的理论依据。
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