食品中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果分析与讨论
时间：2023-01-18 18:20:07 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
马秋莲，周 露，潘馨竹，王 健，马 蓉，徐程伟
（宝应县有机食品质量监督检验中心，江苏扬州 225800）
自然环境中存在大量的李斯特氏菌，该菌有7个菌株，单增李斯特氏菌作为该菌中的一种，能够引发人、动物共同患病[1]。该菌属于食源性致病菌，存在于土壤、粪便、蔬菜和多种食品中。例如，肉制品、水产品及奶制品等更容易受到单增李斯特氏菌的污染[2]。它具有较强的致病性，随着人们所吃的食物一起进入消化系统，会使人们产生败血症、脑膜炎等疾病[3]。因此，我国食品安全标准中严格规定须检测食品中是否存在这种致病菌[4]。
能力验证的本质是借助实验室之间的对比来判断其检测、校准等能力，对实验室检测能力进行评价中多使用该手段。食品检验检测机构在质控中，为了解和判断各实验室是否具备检测出该致病菌的能力，通常为各实验室提供参加能力验证的机会，即通过每一次的能力验证，让每个实验室发现自身存在的问题，从而进行整改，进而不断提高各个实验室的检测技术和质量控制水平[5]；
提高检验人员的检测能力。为了检测本实验室是否掌握食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测能力情况，本实验室参加了大连中食国实组织的单核细胞增生李斯特氏菌检测能力验证活动。实验室严格按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》（GB 4789.30—2016）[6]标准，以BAX Q7为依据快速筛查验证3 个样品，利用高特异性引物原理快速对病原微生物特有的基因信号进行检测。现对本次能力验证的过程、结果及操作等进行总结分析，得出相关结论，为后期检验检测工作的开展提供依据和思路。
1.1 样品来源
大连中食国实提供实验所需的乳粉样品，该样品以人工方式进行污染，其颜色和形状为白色冻干块状，将其分别保存于真空西林瓶中，编号为270、159 和318。
1.2 试剂与仪器
李氏增菌肉汤LB1、LB2；
李斯特氏菌显色平板基（科玛嘉）；
单核细胞增生李斯特氏菌显色培养基平板；
PALCAM 琼脂平板；
含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）；
血平板；
革兰氏染色液；
生化鉴定试剂盒及BAX Q7 试剂盒。
本实验所需的仪器包括电热恒温培养箱、高压灭菌锅、电子天平、均质器、超纯水机和BAX Q7 等。
1.3 实验方法
1.3.1 检验依据
《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》（GB 4789.30—2016）和中食国实能力验证作业指导书。
1.3.2 实验步骤
依据单增李斯特氏菌检验能力验证中的相关标准，先对实验样品进行处理，按照增菌、分离、初筛及鉴定这4 个流程进行具体实验，利用试剂盒、微生物生化鉴定系统及基因指纹图谱鉴定系统对菌种进行鉴定，选择阳性对照菌进行具体实验，最后以报告的形式将实验结果呈现出来。
1.3.3 检测过程
（1）前增菌和增菌。由于样品可能存在致病性，本次实验过程需要在BSL-2 实验室进行，同时使用生物安全柜对实验人员以及样品进行保护。首先无菌开启西林瓶，用40 mL 的生理盐水稀释，此溶液为待测样品原液。用移液管吸取25 mL 待测样品原液到225 mL LB1增菌液中，将其充分混匀，放置在环境温度为29～31 ℃下培养24 h。按照此方法，分别对3 个样品进行处理，并使用单增李斯特氏菌CMCC（B）54002 菌株作阳性对照。使用BAX Q7 试剂盒初步筛选出培养后的增菌液，吸取0.1 mL 经培养过的样品菌液放置于10 mL LB2增菌液中，在温度为30 ℃的环境中培养24 h，以此类推，使用以上相同方法做一个阳性对照，阳性对照是用单增李斯特氏菌FSCC178006 菌株。
（2）分离培养。取LB2增菌液1 环分别将其接种至3 种不同的培养基平板上，划线后3 种平板于36 ℃培养24～48 h。该致病菌在单增李斯特氏菌显色培养基、李斯特氏菌显色平板基及PALCAM 琼脂平板上的代表性菌落形态分别为蓝绿色光滑规则小菌落，且周围有乳白色脂肪沉淀环、棕黑色水解圈小圆形灰绿色菌落；
蓝色，边缘整齐带有白色晕环的菌落；
圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈。
（3）初筛。从上述平板上选取一定量的可疑菌落，本实验中选取的量为每个平板上3～5 个菌，将其接种至鼠李糖、木糖发酵管中，在温度为35～37 ℃的条件下培养24 h，同时在TSA-YE 平板上划线，在温度为35～37 ℃的环境下培养24 h，从中分别选取阴性木糖、阳性鼠李糖阳性的纯培养物，进行进一步的鉴定。
（4）形态学鉴定及生化实验。对TSA-YE 平板上的可疑单菌落分别染色后进行镜检，并依据环凯单增李斯特氏菌成套生化鉴定管说明书进行实验操作，具体参照标准为GB 4789.30—2016 中5.4.1～5.4.5[6]。
2.1 增菌和选择性分离结果
样品270、159 和318 LB2增菌的培养液都比较浑浊，由此可以判定样品中有微生物生长。PALCAM平板上3 个样品呈现出的形状和颜色为圆形、灰绿色，周围生长的单个菌落形态为棕黑色水解圈，该菌落与致病菌的菌落形态颇为相似，说明该菌为单增李斯特氏菌的概率很大；
李斯特显色平板上的270、阳性菌株部分呈现出圆形、蓝绿色，部分为乳白色晕环的单个菌落，依据产品说明书，判断其很可能是单增李斯特氏菌；
李斯特显色平板上的样品159、318 部分呈现出圆形、蓝绿色，生长的单个菌落无乳白色晕环，说明这两种样品为该致病菌的概率很小。此外，样品270 和阳性菌株的单增李斯特氏菌显色培养基均分离出蓝绿色光滑规则的小菌落，而159和318 分离出无色光滑规则的小菌落，则推断出159和318 样品很可能是英诺克李斯特氏菌。
2.2 初筛及生化实验
对样品270 分离的可疑菌落与阳性菌进行对照，其结果与阳性对照结果一致。但是样品159 和318 中分离出的可疑菌落除SIM 生化管，其他生化鉴定结果和阳性对照结果一致，但是溶血试验为阴性，所以排除其为单核细胞增生李斯特氏菌，见表1。使用BAX Q7 试剂盒初步筛选出培养后的增菌液，当温度处于75～80 ℃时，若系统内出现一个峰值，则表示实验有效，当温度为85～90 ℃时，会出现峰值，且峰值较大，表示样品的阳性较强。实验仪器上270 显示为阳性，其余2 种样品显示为阴性。结果见图1～图4。
表1 环凯单增李斯特氏菌成套生化鉴定管鉴定结果
图1 阳性对照BAX Q7 图谱
图2 样品270 BAX Q7 图谱
图3 样品159 BAX Q7 图谱
图4 样品318 BAX Q7 图谱
本次能力验证严格依据GB 4789.30—2016 的检验方法，对可疑菌进行鉴定，鉴定结果发现样品270与阳性菌株的形态一致，而样品159 和318 疑似为英诺克李斯特氏菌，而非单核细胞增生李斯特氏菌。在检测过程中发现，PALCAM 培养基在区分单核细胞增生、英诺克李斯特氏菌这两种菌方面存在一定的局限性，主要原因是PALCAM 培养基中的七叶苷成分，而实验中的这两种菌都能水解七叶甙，并与铁离子发生化学反应，让菌落颜色反应为棕褐色，产生褐色晕圈，所以无法对这两种菌进行有效区分[7]。
能力验证不仅可以衡量实验室的检测能力，而且可为实验室内外部质控提供有效手段。实验室通过参加本次检测能力验证活动，全面了解本实验室关于食品微生物的检测能力，并且本次能力验证中所使用的培养基、试剂及实验仪器设备等与本实验室日常实验工作所使用的一样，不仅能够验证本实验室的检测能力及试验方法、结果的精确度，还有利于提高本实验室内控质量水平和检验能力，为后期食品微生物检验检测工作实施提供新思路。
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