基于网络药理学的荔枝核抗肝纤维化作用机制研究▲
时间：2023-01-17 13:40:11 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
黄菊芳 张扬武 黎敏航 罗 婷 罗伟生
(1 广西中医药大学研究生院，广西南宁市 530001；
2 广西中医药大学瑞康临床医学院， 广西南宁市 530011)
肝纤维化是肝内纤维组织异常增生，肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)活化，细胞外基质大量产生、沉积并出现合成与降解失衡，继发肝脏自我修复的动态可逆性病理过程[1]。肝纤维化会损害肝组织的结构和功能，其若得不到阻抑或逆转则可能进展为失代偿期肝硬化，并导致各种终末期肝病相关并发症的发生，如消化道出血、感染、肝性脑病、肝肾综合征等，进而严重影响患者生存质量和预后，甚至导致死亡[2]。如在早期阶段给予有效的治疗，肝纤维化具有可逆性[3]。研究表明，中药可通过抑制HSC活化[4]与肝内炎症反应[5]，调节脂肪细胞因子[6]，以及调控氧化应激[7]等方式，发挥延缓肝纤维化的作用。因此，从中医药中寻找有效的抗肝纤维化药物具有必要性和重要性。荔枝核为无患子科荔枝属植物荔枝的干燥成熟种子，味甘、微苦，性温，归肝、肾、胃经，具有行气散结、祛寒止痛的作用[8]。荔枝核的主要成分包括荔枝核皂苷、挥发油、总黄酮、糖类等[9]。研究表明，荔枝核总黄酮为抗肝纤维化的主要有效活性成分[10-11]。本课题组前期研究提示，荔枝核总黄酮通过调节转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)[12]、基质金属蛋白酶抑制剂-1[13]及过氧化物酶体增殖物激活受体γ/c-Ski[14]等信号通路的表达来减轻肝细胞的损伤，达到抗肝纤维化的作用。但是肝纤维化涉及的细胞分子机制极其复杂，目前荔枝核抗肝纤维化的相关活性成分有待进一步开发。网络药理学旨在研究药物、疾病、靶标三者之间复杂多样的关系，为中医药的传承创新提供了一种新方法。故本文采用网络药理学方法，从整体性的角度对荔枝核抗肝纤维化作用机制进行探讨，为深入研究荔枝核及含荔枝核的中药复方的抗肝纤维化作用提供参考。
1.1 检索荔枝核有效活性成分 以“荔枝核”为检索词，通过中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP；
https://tcmspw.com/tcmsp.php)检索荔枝核的活性成分，设定口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、类药性(drug-likeness，DL)≥0.18作为主要有效活性成分的筛选条件[15]，获取荔枝核的有效活性成分，并将结果导入Excel表格。
1.2 预测荔枝核主要有效活性成分的作用靶点 采用 Perl 软件(https://www.perl.org/)对荔枝核有效成分的作用靶点进行预测，然后利用UniProt在线蛋白质数据库(https://www.uniprot.org)查找作用靶点对应的标准基因名。
1.3 筛选肝纤维化相关靶点 在GeneCards®数据库(https://www.genecards.org)、OMIM®数据库 (https://omim.org)中，以“liver fibrosis”“fibrosis”“hepatofibrosis”为关键词获取肝纤维化相关靶点，去除重复靶点。
1.4 获取荔枝核-肝纤维化靶点 通过微生信网站(http://www.bioinformatics.com.cn/)将肝纤维化相关靶点和荔枝核有效成分的作用靶点取交集，绘制韦恩图，得到荔枝核-肝纤维化靶点，即荔枝核抗肝纤维化的靶点。
1.5 构建“中药-活性成分-基因靶点-疾病”网络 将1.2获得的荔枝核主要有效成分的作用靶点和1.4获得的荔枝核-肝纤维化靶点输入Perl软件进行映射，然后运用CytoScape软件3.7.0进行可视化分析，得到“中药-活性成分-基因靶点-疾病”网络图。
1.6 建立蛋白-蛋白相互作用网络及筛选核心基因 在STRING数据库(http://string-db.org/)中输入荔枝核-肝纤维化靶点，选择多种蛋白质，限定研究生物为“homosapiens”，将获得的tsv文件导入CytoScape软件构建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络图，将tsv的文件输入R语言软件3.6.1(https://www.r-project.org/)并运行，根据邻接节点数目，得到PPI网络核心基因。
1.7 功能和通路富集分析 将荔枝核-肝纤维化靶点输入R语言软件3.6.1，进行基因本体论(Gene Ontology,GO)功能富集分析(主要分析生物学过程)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信号通路富集分析。
2.1 荔枝核的主要有效活性成分 利用TCMSP平台检索到荔枝核的有效成分72个，根据设定的OB和DL进行筛选，共获得荔枝核的有效活性成分 8个，见表1。
表1 荔枝核的主要有效活性成分
2.2 荔枝核-肝纤维化靶点 获得荔枝核主要有效活性成分的作用靶点87个，以及肝纤维化相关靶点6 899个，将两者取交集，得出79个荔枝核-肝纤维化靶点，包括前列腺内过氧化物合酶1(prostaglandin-endoperoxide synthase 1,PTGS1)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)、毒蕈碱型乙酰胆碱受体(cholinergic receptor muscarinic,CHRM)3、CHRM1、CHRM2、肾上腺素受体α1A(adrenoceptor alpha 1A，ADRA1A)、烟碱型乙酰胆碱受体α1亚单位(cholinergic receptor nicotinic alpha 1 subunit,CHRNA2)等。见图1。
图1 荔枝核-肝纤维化靶点的韦恩图
2.3 “中药-活性成分-基因靶点-疾病”网络 “中药-活性成分-基因靶点-疾病”网络见图2，图中橘色代表肝纤维化，紫色代表荔枝核，蓝色代表荔枝核的主要有效活性成分，黄色代表荔枝核-肝纤维化靶点；
由图2可知，荔枝核主要通过6种有效活性成分(甘露醇、β-谷甾醇、谷甾醇、豆甾醇、表儿茶素、槲皮素)作用于79个荔枝核-肝纤维化靶点，从而发挥干预肝纤维化的作用。
图2 中药-活性成分-基因靶点-疾病”网络图
2.4 PPI网络及核心基因 利用CytoScape软件构建PPI网络图，见图3。共筛选出30个核心基因，根据邻接节点数目由多到少排序为白细胞介素(interleukin,IL)-6、Caspase-3、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、MYC、雌激素受体1(estrogen receptor 1,ESR1)、细胞周期蛋白(cyclin D1)、FOS、Erb-B2 受体酪氨酸激酶2(Erb-B2 receptor tyrosine kinase 2,ERBB2)、雄激素受体(androgen receptor,AR)、RELA、过氧化物酶体增生激活受体γ(peroxisome proliferative activated receptor gamma,PPARG)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)3、孕激素受体(progesterone receptor,PGR)、Caspase-8、陷窝蛋白1(caveolin 1,CAV1)、缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)1A、芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AHR)、细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM1)、Caspase-9、核因子红细胞2相关因子2(nuclear factor,erythroid 2 like 2,NFE2L2)、核因子κB抑制因子α(nuclear factor kappa-B inhibitor alpha，NFKBIA)、细胞色素P450家族3亚家族A成员4(cytochrome P450 family 3 subfamily A member 4,CYP3A4)、NAD(P)H苯醌脱氢酶1 [NAD(P)H quinone dehydrogenase 1,NQO1]、RB1、cyclin B1、热休克蛋白(heat shock protein,HSP)B1、胰岛素生长因子2(insulin growth factor 2,IGF2)、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1(poly ADP-ribose polymerase 1,PARP1)、血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM1)，见图4。
图4 PPI网络核心基因
2.5 GO富集分析结果 荔枝核-肝纤维化靶点共参与了101个生物学过程，主要为RNA聚合酶Ⅱ特异性、DNA结合转录激活因子活性、核受体的活动、配体激活的转录因子活性、类固醇激素受体活性、激活转录因子结合、乙酰胆碱受体的活动、类固醇结合、泛素样蛋白连接酶结合、谷胱甘肽结合、突触后神经递质受体活动等，见图5。
图5 GO 功能富集分析柱状图
2.6 KEGG通路分析结果 荔枝核-肝纤维化靶点共涉及74条信号通路，涉及的信号通路主要与炎症途径密切相关，如人类巨细胞病毒感染、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、细胞凋亡、HIF-1、肿瘤坏死因子、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、EB病毒感染、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、甲型流感、p53等信号通路。见图6。
图6 KEGG通路分析柱状图
中医药是一个多组分的药物协同体系，针对不同疾病具有独特的治疗作用。本研究应用网络药理学方法，通过TCMSP数据库筛选出荔枝核的8个主要有效活性成分，以及主要有效活性成分的作用靶点87个；
在GeneCards®、OMIM®数据库中得到肝纤维化相关靶点6 899个，与荔枝核主要有效活性成分的作用靶点取交集后，得到荔枝核抗肝纤维化的靶点79个，荔枝核抗肝纤维化的可能关键成分6个，分别为槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、甘露醇、谷甾醇、表儿茶素。槲皮素属于黄酮类天然化合物，广泛存在于自然界的水果、中草药及绿叶蔬菜。研究表明，槲皮素具有抗癌[16]、治疗糖尿病[17]、抗氧化[18]等作用。Wu等[19]研究发现，槲皮素可通过调节TGF-β1/Smads与PI3K/AKT通路之间的连接来减弱HSC的活化并减少自噬，并促进基质降解，从而预防了肝纤维化的发生和发展。Li等[20]研究发现，黄酮类槲皮素通过抑制巨噬细胞浸润并通过靶向(Notch受体1，NOTCH1)途径调节M1型巨噬细胞极化，从而减轻肝脏炎症和纤维化。这说明槲皮素可通过抑制HSC的活化而成为抗纤维化的潜在药物。β-谷甾醇是一种类胆固醇的植物甾醇，可从各种植物中提取获得。Kim等[21]研究发现，β-谷甾醇通过对肝纤维化基因的mRNA、蛋白质表达水平的调节，以减轻肝纤维化小鼠的肝脏损伤并防止胶原蛋白积聚，也可通过抑制氧化应激和HSC活化标志物来发挥抗肝纤维化的作用[22]，这表明β-谷甾醇可能是肝纤维化的潜在治疗剂。有研究表明，豆甾醇对四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化具有改善作用[23]。总之，荔枝核的多种有效活性成分具有一定的抗肝纤维化作用。
本研究通过PPI网络可知，荔枝核抗肝纤维化的核心靶点包括IL-6、Caspase-3、EGFR、VEGFA、MYC、ESR1、cyclin D1、FOS、ERBB2、AR、RELA、PPARG、NOS3、PGR等。有研究表明，通过下调依赖于IL-17A的IL-6/信号转导及转录激活因子3信号通路可以改善肝纤维化[24]；
通过调节Caspase-3/活化型Caspase-3蛋白来抑制B细胞淋巴瘤2蛋白的表达，可诱导HSC凋亡，达到预防肝细胞损伤的目的[25]；
诱导型NOS的表达水平升高而内皮型NOS的表达水平降低，与肝纤维化中氧化应激标志物的升高密切相关[26]；
激活蛋白1转录因子亚基FOS相关抗原1(FOS like 1,activator protein-1 transcription factor subunit，Fra-1)与肝纤维化有关[27]。此外，Fra-1的表达升高可以防止对乙酰氨基酚引起的肝损伤[28]。由此可见，上述这些靶标都有可能是荔枝核抗肝纤维化的主要调节因子。
本研究KEGG通路分析结果显示，荔枝核抗肝纤维化的靶点涉及p53、PI3K/AKT、HIF-1等信号通路。p53信号通路在多种疾病，尤其是肿瘤疾病中起重要作用[28]。肝细胞中p53信号的激活会导致细胞凋亡，从而激活HSC，是肝纤维化的启动因子，而抑制p53信号通路的传导对肝细胞具有保护作用[29]。p53可促进HSC铁死亡的上游分子，而通过小干扰RNA技术下调p53基因可阻断HSC的铁死亡，进而加重肝纤维化[30]。PI3K/AKT通路参与调节HSC活化和增殖、胶原蛋白合成，促进肝纤维化的进展[31]。体外实验研究表明，通过下调PI3K/AKT信号通路可显著抑制HSC增殖，其有可能成为临床抗纤维化治疗的靶点[32]。纤维化酶赖氨酰氧化酶是一种分泌型胺氧化酶，可催化细胞外基质中胶原纤维之间共价交联的形成，组织缺氧及其他刺激会增加纤维化酶赖氨酰氧化酶的表达，而这一过程主要由HIF-1主导[33]。肝纤维化可能与肝细胞缺氧相关，而纤维化酶赖氨酰氧化酶和相关蛋白可能在肝纤维化的发展中起到关键作用[34]。
综上所述，荔枝核抗可能通过甘露醇、β-谷甾醇、谷甾醇、豆甾醇、表儿茶素、槲皮素等有效活性成分，干预多靶点、调节多条信号通路来达到抗肝纤维化的效果。本研究结果或可为荔枝核治疗肝纤维化提供一定的依据，也可为临床抗肝纤维化及中药的开发提供一定的思路。然而，本研究仍存在一些不足之处：首先，本研究仅基于肝纤维化的现有靶点进行分析，这可能会遗漏一些作用于新治疗靶点的中药活性成分；
其次，本研究不能区分一种成分是直接与靶点结合还是间接影响靶点。深入、系统地探讨荔枝核抗肝纤维化的机制研究，以及开展高质量的实验研究，将是今后进一步研究的方向。
