细菌中I型毒素蛋白与细胞膜相互作用机制的研究进展*

于 茹 赵立岭 李娥娥 陈明翠 赵 立 郭陈刚 于家峰* 曹赞霞*

（山东省生物物理重点实验室，德州学院生物物理实验室，德州 253023）

细菌中I型毒素-抗毒素（toxin-antitoxin，TA）系统一般是由两个基因组成的单个操纵子。其中，毒素基因编码稳定的毒素蛋白，其过表达可抑制细菌生长或导致细菌死亡；
抗毒素基因编码不稳定的抗毒素分子小RNA（small RNA，sRNA），其一般通过配对与毒素蛋白的mRNA相互作用，抑制毒素蛋白mRNA的翻译和/或诱导其降解［1］。I型TA系统在细菌基因组中广泛存在，在人类微生物群系中也能发现部分I型毒素蛋白如TisB、Hok等，其生物功能和细菌的生物进化密切相关，包括促进耐药菌形成、抑制细菌生长或引发细菌程序性死亡等［2］。I型TA系统中的毒素蛋白通常是小的疏水跨膜蛋白（一般<60个氨基酸），具有预测的α螺旋跨膜结构域，不同的毒素蛋白生物活性各不相同。当细菌正常生长时，抗毒素分子的存在会阻止毒素蛋白的活性，TA系统不会对细菌产生任何威胁作用。但当细菌受营养、压力、毒性、低氧、高温、抗生素等外界环境胁迫时，不稳定的抗毒素分子转录水平下调或者被快速降解，引起I型毒素蛋白在细菌中过量表达并累计。这时游离的毒素蛋白与其作用靶标结合，抑制细菌中多个重要的细胞过程，减缓细菌的生长甚至导致细菌死亡。因此I型TA系统能在细菌的生长、生存过程中发挥多种生物学功能，包括强的红细胞毒性或抗菌功能、促进持留菌形成或抑制细菌生长及导致细菌休眠等。尽管对I型TA系统的研究已有数十年之久，但对其生物学功能和潜在分子机制的解析仍然滞后。当前针对细菌研究的热点是在细菌基因组中寻找新颖TA系统并对其结构特征、功能及作用机制等进行研究，这些研究既为耐药细菌的治疗带来机遇，又为新型抗菌药物的研发带来思路。

大多数I型毒素蛋白的作用被认为类似于噬菌体孔蛋白，即诱导细胞膜成孔，这会影响ATP合成，进而影响DNA的复制、转录和翻译。极少数I型毒素是核酸酶，如RNase SymE和DNase RalR［3-4］。目前关于I型TA系统的研究主要集中在肠道细菌和病原菌中，如革兰氏阴性菌：大肠杆菌（Escherichia coli）［5］、幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）［6］、鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 （Salmonella typhimurium）［7］、梨 火 疫 病 原 菌 （Erwinia amylovora）［8］，及革兰氏阳性菌：艰难梭状芽胞杆菌（Clostridium difficile）［9］、金 黄 色 葡 萄 球 菌（Staphylococcus aureus）［10］、枯 草 芽 孢 杆 菌（Bacillus subtilis）［11］、粪 肠 球 菌（Enterococcus faecalis）［12］、鼠 李 糖 乳 杆 菌 （Lactobacillus rhamnosus）［13］等。对I型TA系统的研究主要包括3方面：a.通过生物信息学方法在转录组测序数据中挖掘潜在的新颖I型TA系统；
b.利用实验方法分析I型TA系统中抗毒素分子sRNA抑制毒素蛋白功能发挥的机制；
c.实验方法分析I型TA系统中毒素蛋白可能的作用靶标和生理功能。表1和表2中列出了部分常见革兰氏阴性菌和阳性菌中定位于细胞膜的I型TA系统及其生物功能、作用机制，并利用TMPRED［14］预测了毒素蛋白的跨膜结构域。

Table 1 Target，biological function and mechanism of type I TA system in Gram-negative bacteria表1部分I型TA系统在革兰氏阴性菌中的靶标、生物功能及作用机制

续表1

Table 2 Target，biological function and mechanism of type I TA system in Gram-positive bacteria表2部分I型TA系统在革兰氏阳性菌中的靶标、生物功能及作用机制

续表2

续表2

1.1 革兰氏阴性菌I型TA系统

大肠杆菌是一种革兰氏阴性杆状细菌，是I型TA系统中研究最广泛的细菌之一。在模式生物大肠杆菌中已证实有20种I型TA系统［5］，其中18种TA系统中的毒素蛋白作用靶标为细胞膜（分别为DinQ、HokA、HokB、HokC、HokD、HokE、IsbA、IsbB、IsbC、IsbD、IsbE、LdrA、LdrB、LdrD、PndA、ShoB、TisB、ZorO），另两种SymE和RalR毒素蛋白靶标不同，是作为核酸酶来介导毒性的［3-4］。第一对被鉴定的I型TA基因是大肠杆菌中R1质粒的hok/sok位点，其中Hok是毒素蛋白，sok是抗毒素sRNA［15］。hok mRNA的半衰期较长，而sok sRNA的半衰期较短。当细胞分裂发生时，未继承R1质粒的子细胞将由于sok sRNA的快速降解和更稳定的hok mRNA翻译而死亡。Hok家族毒素蛋白通过破坏膜的完整性，从而杀死细菌［16］。研究发现，部分Hok蛋白可以通过调节膜去极化的水平，使细菌以可逆休眠的形式持续存在。Gerdes［17］提出一种稳态调控机制调节HokB水平，使膜去极化不会导致细胞活力的不可逆损失，其过程为：由于抗毒素分子sokB的RNase E活性与膜缔合相关，假设膜去极化可能会使RNase E失活，提高sokB的表达量，从而抑制HokB的翻译，遵循这一原理的反馈机制将提供一种保护措施，将HokB的膜去极化作用限制在抑菌水平。与HokB类似，Ldr家族毒素蛋白和TisB毒素蛋白均是在内膜上形成小孔，导致膜渗漏，降低质子动力和ATP水平，从而抑制DNA复制、转录和翻译，最终阻碍细菌的生长，促进持留菌的形成［18］。抗毒素分子rdl调控Ldr转录后水平，而RNA istR-1则通过与翻译起始区上游的待定核糖体竞争抑制TisB毒素的翻译［19］。毒素蛋白DinQ不仅可以使细胞膜去极化致使细菌死亡，同时还可以促进DNA压缩成为类似拟核的结构或者高级的纤维状结构，从而使细胞丧失活力［20］。Elizabeth团队［21］获得5个Ibs毒素蛋白，都具有抑制细菌生长的功能，其中抗毒素分子sibC可以防止ibsC的过量表达而导致的毒性作用［22］。与其作用机制类似的还有pndA/pndB、shoB/ohsC和zorO/orzoTA系统中的毒素蛋白［21，23-24］，且ZorO在发挥细胞毒性作用时没有形成明显的大孔隙［25］。此外，RNase III是一种双链核糖核酸酶，对切割成对的毒素-抗毒素复合物（包 括hok/sok、tisB/istR、zorO/orzO）至 关重要［23，26-27］。

幽门螺杆菌可以通过多种独特策略来调节其基因表达以适应人体胃内的生存环境。Vogel课题组［28］通过全基因组测序和生物信息学技术分析了幽门螺杆菌转录组，发现存在4个保守型I型TA系统家族（A、B、C、D）在其染色体上表达，其中由A类TA系统的5组同源表达模块（aapA1/IsoA1、aapA3/IsoA3、aapA4/IsoA4、aapA5/IsoA5、aapA6/IsoA6）构成了一个新的染色体编码的I型TA系统家族。随后，Darfeuille课题组［29］通过实验方法首次描述了aapA1/IsoA1系统的作用特征及调控机制。aapA1基因的全转录本是翻译失活的，其3"端加工处理后可翻译获得一条长度为30个氨基酸的疏水性毒性蛋白；
同时IsoA1sRNA抗毒素直接靶向毒素基因的翻译起始区，阻止其翻译且加速其降解。AapA1毒素蛋白在幽门螺杆菌中的表达导致其由螺旋形细菌向圆球菌的快速形态转化，且生长停滞并进入休眠状态，这是一种有活力但不可培养状态，是比持留状态更深程度的休眠。AapA1毒素蛋白是第一个被鉴定的圆球菌形成效应物，它以幽门螺杆菌的细胞内膜为靶点但不破坏其内膜。在没有IsoA3抗毒素的情况下，AapA3毒素蛋白在染色体上的表达可以导致幽门螺杆菌死亡。IsoA3通过形成稳定的RNA双链，在翻译水平上抑制aapA3的组成性表达；
且研究表明单核苷酸替换就足以阻碍AapA3毒素翻译，如A40T改变了aapA3 mRNA结构，从而阻止其正常翻译［30］。

沙门氏菌是一种食源性致病菌，迄今为止在其中发现8种大肠杆菌同源的I型TA系统（分别为Hok、IsbA、IsbB、LdrA、LdrB、TisB、SymE、TimP）。其中，SymE和IsbB均未检测到抑制细菌生长的作用，而Hok、IsbA、LdrA、LdrB和TisB均表现出抑制细菌生长的现象［7］。TimP毒素蛋白作用在细胞膜上的机制与Hok和TisB等毒素不同，其N端为一个跨膜信号肽，通过其将多肽直接插入细胞膜，过表达timP会导致生长抑制和膜渗漏。抗毒素timR是一种反义sRNA，通过与timP 5"UTR结合来抑制其翻译［31］。

梨火疫病菌是一种典型的引起苹果和梨等植物毁灭性火疫病的植物致病菌。经研究发现的梨火疫病菌I型TA系统是hok/sok。该Hok毒素与大肠杆菌HokB序列同源性为48%，实验表明其也可以通过破坏细胞膜的去极化从而杀死细菌。另外研究还表明，梨火疫病菌Hok在激活ATP生物合成和激发细菌细胞对细胞膜和抗生素损伤的耐受性方面发挥重要作用。Hok的低水平表达也激活了与应激反应相关的多个基因，并触发了噬菌体休克蛋白基因pspA的表达，从而起到保护梨火疫病菌细胞免受进一步膜应激源伤害的作用［8］。该研究表明，应激调控是TA系统在细菌中低水平表达条件下的重要选择优势。

1.2 革兰氏阳性菌I型TA系统

艰难梭状芽胞杆菌是一种医学上重要的人类肠道病原体，被认为是导致成人抗生素相关性院内腹泻的主要病原菌。Olga研究组揭示了这类细菌上多 组I型TA系 统（CD0440.1/CD630_n00150、CD0904.1/RCd13、CD0956.2/RCd10、CD0956.3/RCd14、CD0977.1/RCd11、CD1233.1/SQ808、CD1418.2/CD630_n00500、 CD2299.1/SQ1641、CD2517.1/RCd8、CD2889/RCd12、CD2907.1/RCd9）的特征［8-9，32-33］。这类毒素蛋白都跟细胞膜相关，能抑制细菌生长并促进其休眠。这类毒素蛋白疏水的N端高度保守，带正电荷的C端区域含有丰富的赖氨酸，且与其他细菌的I型毒素蛋白没有序列同源性。

金黄色葡萄球菌是一种重要病原菌，是革兰氏阳性菌的代表，可引起的感染范围从浅表感染到危及生命的炎症和败血症。在金黄色葡萄球菌中已发现多种I型TA毒素蛋白，包括Fst、PepA1、PepA2、SprG1、SprG2、SprG3和SprG4及其抗毒素分子sRNA。Fst毒素蛋白在细胞内形成孔洞，破坏细胞壁，裂解活性强。SprG1毒素蛋白既不导致穿孔也不导致破裂，而是通过增加细胞壁的分隔影响细胞分裂［34］。SprG1 RNA编码两条长度不同的毒性小肽SprG131和SprG144，SprG144的N端存在更多的正电荷残基使得其裂解红细胞的能力要高于SprG131，而SprG131抗菌能力更强。抗毒素分子SprF1 sRNA一方面可以跟毒素蛋白的mRNA相互结合，抑制其翻译成毒素蛋白SprG1；
另一方面跟核糖体相互作用，抑制细胞内蛋白质的合成，最终导致金黄色葡萄球菌持留菌的形成［10］。SprG的额外拷贝能编码两个较短的毒素蛋白（SprG2和SprG3），其过表达导致金黄色葡萄球菌生长停滞而不是死亡。这几组同源TA系统之间存在交叉调控作用，例如当SprF2或SprF3过度表达时，SprG2和SprG3在生长期间均无法检测到；
另外，SprF1、SprF2或SprF3的表达都可以抑制SprG1的毒性作用［35］。PepA1不仅对自身细胞具有毒害作用，而且可以作为毒素杀死其他细菌及溶解人类红细胞。与PepA1不同，PepA2具有破坏真核生物细胞膜的巨大潜能，表现为很强的细胞毒性，对人红细胞的作用大约是PepA1的10倍［36］，而对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的作用不是很强。中国科学技术大学孙宝林课题组［37］一直致力于研究金黄色葡萄球菌中的毒素-抗毒素系统，其报道了一个由毒素、抗毒素和转录因子3个基因组成的I型TA系统，其中的毒素蛋白具有选择性地抑制细胞生长并阻碍细胞膜上多重耐药外排泵norA的功能。

粪肠球菌是人和动物肠道内主要菌群之一，是一种重要的医院病原菌。FstpAD1是位于粪肠球菌质粒上的I型毒素蛋白，体外实验显示，其既无细胞毒性和溶血特性，也不具有抗菌肽类似功能，但过表达后会导致类核凝聚、染色体分裂和细胞分裂缺陷，进而导致膜通透性增加［38］。FstEF0409是位于粪肠球菌染色质上的I型毒素蛋白，表现有细胞毒性。FstEF0409的表达可降低sRNA抗毒素的稳定性或转录水平，具体毒素机制尚不清楚，但可以确定其发挥功能方式与FstpAD1不同［12］。此外，变异链球菌中Fst-Sm/srSm I型TA系统的过量产生会降低持久性细胞对细菌细胞壁合成抑制剂的耐受水平［39］。鼠李糖乳杆菌中Fst类似物Lpt与细胞膜的作用被认为是通过一种类似洗涤剂的机制，通过胶束化去除双分子层的小块，破坏磷脂层的稳定性，从而导致细胞生长抑制、类核凝聚和细胞膜完整性受损［13］。

枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，广泛分布在土壤及腐败的有机物中，因易在枯草浸汁中繁殖而得名。2005年在枯草芽孢杆菌染色体上首次鉴定出I型TA系统TxpA-ratA［40］。TxpA基因编码一种含有59个氨基酸的毒素蛋白，该蛋白质N端有一个预测的跨膜结构域，C端有带电的氨基酸，可以直接影响细胞膜的结构从而导致细胞裂解。BsrG/SR4是第一个发现的温度敏感型I型TA系统。BsrG不影响膜的通透性，而是诱导膜的异常拓扑，使膜连续内陷，最终导致自溶［41］。BsrE RNA和BsrG RNA的二级结构非常相似，然而与SR4不同，SR5是一种单功能抗毒素，它只能通过招募RNase III促进BsrE毒素mRNA的降解［42］，SR6则可以同时抑制毒素蛋白yonT和yonJ的表达［43］。虽然RNase III对大肠杆菌的生长不是必需的，但在枯草芽孢杆菌中，该基因的缺失是致命的。Durand等［44］研究表明，RNase III在枯草杆菌中的重要性在于它能裂解I型毒素TxpA、BsrE和yonT。有趣的是，枯草芽孢杆菌中BsrG/SR4的RNA被RNase III剪切，而毒素的抑制并不需要这种核糖核酸酶［42］。此外，BsrH/as-BsrH与TxpA/ratA位于同一基因间区域，但BsrH对RNase III不敏感［45］。因此，尽管RNase III在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的I型TA系统中发挥作用，但其抑制作用的重要性在不同的系统中可能是不同的。

绝大部分I型TA系统中的毒素蛋白（除SymE和RalR外）以细胞膜作为靶标，但它们靶向细胞膜时所发挥的生物学功能是多样而复杂的，对其作用机制的系统研究有利于理解其功能。

I型毒素蛋白作用机制的复杂性和生物功能的多样性远超预期，揭示其作用机制的关键是解析其在细胞膜中的三维结构［2］。但I型毒素蛋白在脂质双分子层中并不是形成单一稳定的结构，而是存在多个亚稳态，且这些不同构象态之间处于动态平衡。此外，I型毒素蛋白在脂质双分子层中易聚集，存在多种不同的组装机制，从而导致其可能在细胞膜中形成不同结构进而影响其功能。这些I型毒素蛋白作用的特异性使得实验方法解析其在细胞膜中的结构特征存在很多困难。

2.1 I型毒素蛋白单体结构

迄今为止，已有5种I型毒素蛋白单体的结构被报导（图1）：AapA1（PDB 6GIG［46］）、PepA1（PDB 4B19［47］）、FstpAD1（PDB 2KV5［12］）、LdrD（PDB 5LBJ［48］）和SprG131（PDB 7NS1［2］）。AapA1毒素蛋白在40%TFE溶液的分子结构中，S9~L28倾向于形成α螺旋结构，N端的8个氨基酸则处于完全无序的状态。C端的两个带正电荷残基K29、R30对小肽的毒性影响很大，V26A突变虽然不能改变小肽的结构和带电情况，但对其细胞毒性有很大影响。PepA1毒素蛋白含有30个氨基酸，作用于金黄色葡萄球菌细胞膜上。当PepA1以α螺旋跨膜形式插入细胞膜时，会由不连续螺旋结构变为可延伸的连续螺旋结构，并通过在膜上形成孔洞结构以破坏细胞膜的完整性，最终引发细菌死亡或红细胞裂解。PepA1的N端呈无序状态，C端富含精氨酸。FstpAD1毒素蛋白含有33个氨基酸，以α螺旋形成跨膜结构，而C端7个氨基酸残基以无序状态存在于细胞之内。LdrD具有α螺旋跨膜结构域，并与磷酸胆碱胶束结合而不改变其大小。有趣的是，LdrD在其C端结构域有两个保守的阳离子氨基酸，这种情形与AapA1相同并对AapA1毒性有重要影响。SprG131肽采用单孔折叠构象。在大多数情况下，膜相关的I型毒素蛋白通过去极化和/或与细胞内ATP下降相关的渗透作用干扰膜的完整性，并显示其毒性。只有两种I型毒素HokB和TisB，已经被实验证实在细胞膜上形成孔洞。与TisB导致细菌死亡不同，HokB的孔隙形成直接与持留菌形成相关。如果它们不形成孔隙，这些I型毒素肽结合到膜的表面，会引发类似于抗菌肽的洗涤剂效应。大多数I型毒素蛋白单体具有相似的序列特征及保守的α螺旋结构，但以上关于I型毒素蛋白单体实验结构的研究，并不能解释为何这些具有相似序列特征及保守α螺旋结构的毒素蛋白在靶向细胞膜时却具有不同的生物学功能。因此，将I型毒素蛋白-细胞膜作为一个整体研究对象，考虑蛋白质-蛋白质或蛋白质-脂质之间的相互作用并解析其动态结构才能有助于对其作用机制的理解。

2.2 I型毒素蛋白组装机制

大部分I型毒素蛋白序列短、疏水性强、溶解性差，在细胞膜中易聚集，且不同毒素蛋白的序列之间没有同源性。因此，利用传统结构生物学实验方法解析这类蛋白质在细胞膜中的结构存在很多困难。毒素蛋白/多肽破坏细胞膜的方式主要有以下两类。第一类是跨膜孔模型，毒素蛋白/多肽在细胞膜上形成“桶-板”或“环孔”型孔洞破坏细胞膜；
第二类是非孔模型，毒素蛋白/多肽在细胞膜表面形成“地毯”裂解脂质双分子层。目前，只有两种I型毒素HokB和TisB，有相关实验研究其组装机制和可能的跨膜结构。大肠杆菌毒素蛋白HokB是由49个氨基酸残基组成的单跨膜蛋白，其中C端带负电位于细胞周质，N端带正电位于胞质。该蛋白质中有3个半胱氨酸残基（C9、C14和C46），现已证实C9和C14位于跨膜区，C46暴露。Michiels团队［49］的系列研究揭示，氧化还原酶DsbA可以催化两个单体的C46间形成的二硫键，从而稳定HokB二聚体的结构并使其多聚化形成孔洞结构；
这些孔洞导致细胞膜去极化和ATP的泄漏，从而形成持留菌；
细胞膜上的HokB蛋白越多，持留菌的休眠期越长。HokB孔洞的大小及活性对膜电位敏感，低膜电位倾向于形成中间孔类型，高膜电位倾向于形成成熟孔类型，但是现有实验研究不能区分中间孔洞与成熟孔洞的区别［49］。胁迫条件消失后，细菌的复苏过程是由HokB的单体化及降解和细胞膜的重新极化共同控制的：氧化还原酶DsbC还原多聚体中的二硫键使HokB单体化，从而破坏孔洞；
孔洞被破坏后胞内的电子传递链使细胞膜重新极化并生成ATP，导致胞内pH降低，从而激活蛋白酶DegQ降解单体化的HokB［49］。大肠杆菌毒素蛋白TisB是由29个氨基酸残基组成的跨膜蛋白，其中带大量正电荷残基［48］。实验及分子动力学模拟表明，插入细胞膜的TisB通过由4个盐桥组成的电荷拉链组装成反平行二聚体［50］，并通过反平行二聚体-二聚体形成四聚体束的形式垂直插入膜中［51］，形成直径很小的阴离子选择性孔洞结构［48］；
组成孔洞结构的跨膜四聚体通过一种规则动态的盐桥和氢键来稳定［51］，四聚体中的两亲螺旋与细菌内膜相互作用，从而破坏跨内膜的pH梯度，进而破坏跨膜质子动力势并耗尽ATP，使细菌进入休眠并形成生物膜［51］。第二类作用机制中，毒素蛋白通过其所带正电荷残基与磷脂膜中带负电荷的头部基团发生相互作用，使得膜张力发生改变；
当毒素蛋白积累到一定浓度，膜张力使细胞膜变薄，最终导致细胞膜的破裂。毒素蛋白/多肽破坏/影响细胞膜的作用机制非常复杂，揭示其作用机制的关键是解析其三维结构。因此将多肽-细胞膜作为一个整体研究对象，考虑多肽-多肽或多肽-脂质之间的相互作用并解析其动态结构才能有助于对其作用机制的理解。

I型TA系统中，毒素蛋白序列结构特征以及细胞膜组成是影响毒素蛋白作用机制及生物功能的两个重要因素。例如，PepA1和PepA2毒素蛋白有50%的序列同源性，其N端都富含疏水氨基酸，C端富含带正电荷氨基酸。但这两个毒素蛋白的功能差异显著，PepA2对人红细胞的毒性作用大约是PepA1的10倍，PepA1不仅对自身细胞具有毒害作用，而且可以作为毒素杀死其他细菌。为何序列相似的两个毒素蛋白其功能却差异显著？PepA1毒素蛋白以跨膜α螺旋形式在细胞膜上形成孔洞结构而破坏膜的完整性，最终引发细菌死亡或红细胞裂解，其孔洞的形成路径及结构特征仍不清楚。另外，AapA1毒素蛋白能在不破坏细胞膜的情况下，使幽门螺杆菌由螺旋形细菌向圆球菌转化，且使其生长停滞并进入休眠状态，是否细胞膜结构的改变影响其转运？I型毒素蛋白-细胞膜体系具有较大的作用特异性，这使得生物信息学预测软件及常规实验方法在研究其序列-结构-功能关系及作用机制方面存在很多困难。由于分子动力学模拟能够观察研究对象结构的细微变化，有利于上述问题的研究，因而该方法被认为是研究蛋白质/多肽-细胞膜体系的动态结构及其作用机制的重要工具。Steinbrecher等［50］基于常规的粗粒化模拟，研究了TisB毒素蛋白在DMPC细胞膜表面或以跨膜形式存在时的结构特征，发现TisB毒素蛋白单体会很快结合到细胞膜表面，其二聚体的跨膜结构很稳定。Schneider等［51］将粗粒化模型与全原子模拟结合，研究了TisB毒素蛋白二聚体及四聚体在POPC细胞膜里的孔道结构、特征及关键相互作用，认为TisB毒素蛋白会在反平行二聚体基础上形成四聚体结构（图2）。Sayed等［47］基于常规的全原子模拟，研究了PepA1单体在DPPC膜里的跨膜结构特征。Korkut等［46］利用模拟方法研究了AapA1单体以跨膜形式在POPC膜内部和POPC/POPG膜表面的结构特征，发现AapA1单体的跨膜结构很稳定。这些模拟工作通常是将单个或多个毒素蛋白放在细胞膜表面或直接以跨膜螺旋的形式放在细胞膜内部，以研究毒素蛋白-细胞膜体系的结构特征，包括细胞膜性质和多肽构象的变化，多肽浓度、残基突变及不同细胞膜对相互作用的影响，毒素蛋白所形成孔洞结构的大小性质，不同细胞膜成份如何影响孔洞结构等。受采样方法和采样时间限制，这类模拟研究很难直接观察到毒素蛋白在细胞膜中的多种自由能极小状态及可能形成的不同大小的孔洞结构。

I型毒素蛋白（除SymE和RalR毒素蛋白外）单体具有相似的序列特征（序列长度为20~65个氨基酸的疏水多肽）及保守的α螺旋结构，但它们靶向细胞膜时所呈现的生物学功能是多样而复杂的。实验证实的生物功能主要分为以下3类：a.有细胞毒性或杀菌功能；
b.促使持留菌形成或抑制细胞生长；
c.致细菌形态变化但不破坏细胞膜完整性。I型TA系统通过多种复杂的作用机制发挥多样生物学功能，对其作用机制的系统研究既能够给耐药细菌的治疗带来机遇，又为新型抗菌药物的研发带来思路。

对I型TA系统作用机制及生物功能的理解，能加强对耐药菌形成机制及调控机制的认识，为耐药细菌的治疗提供新的途径。I型毒素蛋白作用机制复杂多样，目前已知的一种作用机制是在细胞膜上形成孔洞结构，造成膜电位的下降或细胞膜的破坏，从而抑制ATP的合成或导致细菌死亡。这些孔洞结构的大小、性质及特征是影响其作用机制的关键因素。另一种可能的作用机制是毒素蛋白作用在细胞膜上，改变细胞的形状，导致细胞进入休眠状态。

细胞膜相关的I型毒素蛋白被认为是设计新的抗菌药物的先导化合物，对I型毒素结构的解析有利于认识其结构-功能关系，从而推进抗菌药物和新型抗生素研发的进程。在体外培养基内加入SprG131、SprG144和SprA1对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等具有杀菌作用［52-53］。SprA1毒素的特殊化学修饰能极大地提高其在人血清中的抗菌潜力和稳定性，具有一定的耐药性，同时大大降低了其对人细胞的毒性，证实了毒素可以转化为强效抗生素［54］。ZorO毒素中ALLRL肽段对革兰氏阳性菌，包括金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌，均有抗菌作用［55］。此外，作为抗菌剂研发的候选药物DinQ，已证实对治疗大肠杆菌感染具有疗效［56］。

大部分I型毒素蛋白以细胞膜作为靶标，在脂质双分子层中并不是形成单一稳定的结构，而是存在多个亚稳态，且这些不同构象态之间处于动态平衡。并且，I型毒素蛋白在脂质双分子层中易聚集，存在多种不同的组装机制，从而导致其可能在细胞膜中形成不同结构进而影响其功能。但是，目前对I型毒素蛋白的作用机制及影响其作用机制的关键序列及结构因素依然知之甚少。寻找新颖I型TA系统并对其结构特征、功能及作用机制进行研究是当前针对细菌的研究热点，但实验方法很难解析I型毒素蛋白在细胞膜中的结构。因此，如何基于机器学习及分子动力学模拟发展一套适用于I型毒素蛋白-细胞膜体系的计算模拟方法，揭示I型毒素蛋白-细胞膜体系的结构-功能关系是系统研究其作用机制的有效途径。

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