超声波辅助提取亳桑皮总黄酮工艺优化及抗氧化活性研究
时间：2022-12-08 22:25:01 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
董琪，鲍伟，刘露,2，李娜,3，吴兵,吴文睿,2*
(1.亳州学院 生物与食品工程系，安徽 亳州 236800)；
2.养生型配制酒亳州市重点实验室，安徽 亳州 236800；
3.药食同源功能食品亳州市重点实验室，安徽 亳州 236800)
我国桑树资源丰富，包括桑叶、枝、根皮和果，中医药典籍、验方中多有桑树资源用于治疗疾病的记载[1]。桑白皮为桑科植物桑(Morus alba L.)的干燥根皮，有泻肺平喘、利水消肿之功效[2]。桑白皮以产区分为亳桑皮(安徽亳州)，严桑皮(浙江淳安)、苏北桑皮(江苏泰兴、南通)三大产区，其中安徽亳州产桑白皮因产量大、色白、皮厚、柔韧者、质量好而优于江浙两处，故亳州桑白皮称为“亳桑皮”[3]，享誉全国。亳桑皮降血糖、降血压、抗病毒、利尿等药用价值也被充分挖掘，受到了医学界的认可[4]。目前，对桑白皮的研究多集中在不同产地[5]、疾病治疗[6]、药理药效[7-8]化学成分分析[9]、炮制[10-11]等方面。
亳白皮所含的化学成分主要为黄酮类物质，如桑素、桑黄酮、桑白皮素、桑根酮等，具有降血糖和血脂，镇咳平喘、消炎抗氧化等药理作用[12]。本研究结合超声波辅助法，采用单因素实验和正交实验设计，对亳桑皮总黄酮提取工艺进行了优化;以维生素 C 作为阳性对照，对亳桑皮黄酮的抗氧化活性进行研究，为亳桑皮的进一步开发和利用提供一定的理论依据。
1.1 材料与仪器
亳桑皮：购买于亳州康美大市场；
芦丁标准品(含量≥99%)：江苏永健医药科技有限公司；
三氯化铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾、过硫酸钾、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、无水乙醇、均为分析纯，天津致远化学试剂有限公司；
2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)：Ruibio公司；
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：合肥巴斯夫生物科技有限公司；
0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液(PH=8.2)：厦门海标科技有限公司。
UV-752 型紫外分光光度计，上海光谱仪器厂；
WB400US超声波清洗器，上海望标仪器有限公司；
DE-200g高速万能粉碎机，浙江红景天工贸有限公司；
JA2003电子分析天平，上海衡平仪器仪表厂；
BGZ-140电热鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；
L600高速台式离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；
HH-3A单列单控三孔水浴锅，常州国宇仪器制造有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 样品制备 亳桑皮处理：亳桑皮→筛选→清洗→低温干燥→粉碎→过筛(40目)→保存备用。
亳桑皮黄酮提取液制备：精密称取5 g亳桑皮粉，按照单因素和正交试验料液比要求，超声提取，过滤，去残渣，将滤液转移到容量瓶中，用一定浓度的乙醇稀释至刻度，得样品液，备用。
1.2.2 总黄酮含量的测定 芦丁标准曲线制备：以芦丁为标样，采用分光光度法制作芦丁标准曲线，参考相关文献略有修改[13]。准确称量50 mg芦丁标准品置于50 mL容量瓶中定容，得1 mg/mL的芦丁标准品溶液。分别取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL的1 mg/mL芦丁标准品溶液分别置于10 mL容量瓶中定容，每个容量瓶的浓度即为0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL。分别取1 mL不同浓度标准液于7支试管中，滴加5% NaNO2溶液0.3 mL，震荡混匀，静置6 min，再滴加10% Al(NO3)3溶液0.3 mL，震荡混匀，静置6 min；
加入 4% NaOH溶液4.0 mL、4.4 mL60%乙醇，震荡混匀，静置15 min，在510 nm波长处测量吸光度，每样需平行3次。以吸光度值为纵坐标(Y)，以芦丁浓度(mg/mL)为横坐标(X)，得到标准曲线得回归方程为 y = 0.1043x—0.0887，R2=0.9826，线性关系良好，可用于亳桑皮总黄酮的测定。检测样品中提取总黄酮与亳桑皮样品的质量百分比即为总黄酮的提取率。
1.2.3 亳桑皮提取工艺优化设计 乙醇体积分数对亳桑皮总黄酮提取率的影响：称取亳桑皮粉末5 g，料液比为1:30(g/mL)，超声波时间45 min，温度为60 ℃，乙醇体积分数分别为50%、60%、70%、80%，在此条件下测量亳桑皮总黄酮的提取率。
提取温度对亳桑皮总黄酮提取率的影响：称取亳桑皮粉末5 g，在最佳乙醇体积分数条件下，料液比为1∶30(g/mL)，超声波时间45 min，温度分别为30、45、60、75 ℃，在此条件下测定亳桑皮总黄酮的提取率。
提取料液比对亳桑皮总黄酮提取率的影响：称取亳桑皮粉末5 g，在最佳乙醇体积分数和温度条件下，超声波时间45 min，料液比分别为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，在此条件下测定亳桑皮总黄酮的提取率。
超声时间对亳桑皮总黄酮提取率的影响：称取亳桑皮粉末5 g，在最佳乙醇体积分数、温度和料液比条件下，超声波分别处理30、45、60、75 min，在此条件下测量亳桑皮总黄酮的提取率。
在单因素试验的基础上，选取乙醇体积分数、提取温度、料液比和超声波处理时间4个因素，每个因素取3个水平，以亳桑皮总黄酮提取率作为考察指标，进行L9(34)正交试验设计(见表1)，得到最佳提取条件。
表1 正交试验因素水平表L9(34)
1.2.4 亳桑皮黄酮的抗氧化活性测定 亳桑皮黄酮提取物对DPPH·清除能力的测定：参照文献[14-15]中DPPH·法测定抗氧化能力，略有修改。将亳桑皮黄酮提取液配置成不同的质量浓度，分别取2 mL样品，然后加入2 mL的0.1 mmol/L DPPH(以无水乙醇作为溶剂)，混匀，于黑暗条件下反应30 min，于517 nm处测定吸光度。以 VC为阳性对照。亳桑皮黄酮对DPPH·的清除率依据下列公式计算：
清除率(%)=[1-(A-A0)/A1]×100
(1)
其中，A为样品组与自由基溶液混合后的吸光度值；
A0为样品本身的吸光度，未加自由基溶液；
A1为未加样，只加自由基溶液的吸光度值。
亳桑皮黄酮提取物对ABTS·清除能力的测定：参照文献[16]中ABTS·法测定抗氧化能力，略有修改。将7 mmol/L ABTS溶液10 mL与140 mmol/L的过硫酸钾溶液0.2 mL在黑暗中混匀静止15 h，得ABTS自由基溶液。将该溶液配制成不同质量浓度，备用。将1 mL亳桑皮总黄酮提取液、2 mL ABTS自由基溶液及1 mL蒸馏水依次加入试管中，于黑暗条件下反应30 min，后于734 nm 下测定吸光度。通过公式(1)计算清除率并以VC为阳性对照。
2.1 单因素实验结果
单因素实验结果如图1—4所示。由图1可知，亳桑皮黄酮提取率随乙醇体积分数的増大而逐渐提高，但当乙醇体积分数大于70 %后，提取率略有下降，增加乙醇浓度，总黄酮的提取率反而降低，可能是因为高浓度乙醇对样品中脂类物质产生一定的溶解性所致。而乙醇体积分数60 %时亳桑皮总黄酮提取率与70 %接近。因总黄酮为极性化合物，结合相似相溶原理，调节不同体积分数的乙醇溶液，改变其极性，达到总黄酮的提取效果最佳。综合考虑选取乙醇体积分数为60 %，作为后面的试验继续考察。
图1 不同乙醇体积分数对亳桑皮总黄酮提取率的影响 图2 提取温度对对亳桑皮总黄酮提取率的影响
由图2可知，随着提取温度不断升高，亳桑皮总黄酮提取率逐渐增高；
提取温度在60 ℃时提取率达到最大值，温度过高可能会导致总黄酮分解或挥发。由此选取提取温度为60 ℃，作为后面的试验继续考察。
由图3可知，提取剂的增加更有利于总黄酮的溶出，亳桑皮总黄酮提取率随物料与溶剂的比例的増大而呈现先增高后降低的趋势，当料液比大于1:30时，总黄酮的提取率有下降趋势，可能因为当溶剂过大时，热效应、空化效应和机械效应等效应的强度减弱，影响提取的效果，也一定程度上造成浪费。由此选取料液比为1:30 g/mL，作为后面的试验继续考察。
图3 料液比对亳桑皮总黄酮提取率的影响 图4 超声时间对亳桑皮总黄酮提取率的影响
由图4可知，超声30 min，亳桑皮总黄酮不能充分转移到溶剂中，随着超声时间的延长，总黄酮的提取率呈现先增加后降低的趋势，超声时间在45 min时，提取率达到最大值，因此选取提取时间为45 min，作为后面的试验继续考察。
2.2 正交试验结果
正交试验结果如表2所示。根据极差分析，各因素对亳桑皮总黄酮提取率的影响由大到小分别是料液比>超声时间>提取温度>乙醇体积分数，最佳组合为A2B3C3D3，即亳桑皮总黄酮最佳提取工艺为：乙醇体积分数为60 %、提取温度为65 ℃、料液比(g/mL)为1:35、超声时间为50 min。通过验证性试验可知，按照最佳的提取工艺，亳桑皮总黄酮的提取率为3.52 %。
表2 正交试验结果L9(34)
2.3 亳桑皮黄酮的抗氧化活性测定结果
亳桑皮对DPPH·清除率测定结果如图5所示。从图5可以看出，较维生素C相比，亳桑皮黄酮对DPPH·有较强的清除率，随着亳桑皮黄酮溶液浓度的增大，其对DPPH·的清除率越来越高，清除效果与浓度之间都存在明显的量效关系。在黄酮浓度20～100 μg/mL的浓度范围内，其对 DPPH·的清除能力为25.6～73.4 %。亳桑皮黄酮清除DPPH·的IC50值为32.05 μg/mL。
图5 亳桑皮黄酮清除DPPH·的能力 图6 亳桑皮黄酮清除ABTS·的能力
亳桑皮对ABTS·清除率测定结果如图6所示。从图6可以看出，较维生素C相比，亳桑皮黄酮对ABTS·的清除率略低于维生素C，但仍有较强的清除率，随着亳桑皮黄酮溶液浓度的增大，其对ABTS·的清除率越来越高，清除效果与浓度之间都存在明显的量效关系。在黄酮浓度20～100 μg/mL的浓度范围内，其对 ABTS·的清除能力为34.2～79.4 %。亳桑皮黄酮清除ABTS·的IC50值为26.48 μg/mL。
图7 亳桑皮黄酮清除的能力
本文通过单因素实验和正交试验设计，借助超声波辅助提取亳桑皮总黄酮，得到最佳工艺条件为：乙醇体积分数为60 %、提取温度为65 ℃、料液比(g/mL)为1:35、超声时间为50 min，亳桑皮黄酮的提取率为3.52 %。
