超高效液相色谱-串联质谱法检测茶叶中15种农药残留
时间：2022-12-08 18:45:03 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
方向丽
（池州市农产品质量安全监测中心，安徽池州 247000）
茶叶为多年生木本植物，产茶区遍布15个省（市、自治区），在南纬45°与北纬38°之间都可以种植。茶树喜温喜湿，适宜生长温度为18～25℃，需要年降水量1 500 mm左右且分布均匀。一般朝晚有雾、相对湿度85%左右的地区，比较适宜茶树生长。茶叶春、夏、秋季均可采摘，主要集中在春季。茶叶采摘季节多，病虫害具有多、广、复杂等特点。茶叶病害主要有茶饼病、茶炭疽病、茶赤星病等，虫害主要有茶小绿叶蝉、叶蝉类害虫、黑刺粉虱、茶蚜、象甲类等。如果不及时防治病虫害，茶叶产量和品质会大幅下降[1]。目前，茶树病虫害防治仍以化学防治为主。茶农生态意识薄弱，未按相关规范合理用药，导致茶叶中仍然存在农药残留。90%以上农药残留来自茶叶种植阶段，种植阶段农药使用种类繁多。农药用量和茶叶采摘期的差异使农药残留量波动范围较广，因而对检测方法的线性范围要求更宽。加工工艺方面，绿茶为不发酵茶，乌龙茶为轻发酵茶，红茶和普洱茶为全发酵茶。加工过程特别是萎凋阶段工艺不同使各类茶叶的内含物质差异较大。茶叶加工对农药残留检测的影响主要体现在以下几个方面：经过加工后的茶叶组织间隙更小，对提取溶剂的渗透率要求高；
加工后的茶叶水分大幅下降，糖类、茶多酚、氨基酸、咖啡碱等浓度上升，增加了后期去除干扰成分的难度；
农药与部分茶叶内含物质可能存在相互作用。同时，一些茶叶内含物质对农药残留检测也有影响，如糖类、茶多酚、氨基酸等高沸点、难挥发的化合物在高温下会污染进样口、锥孔等。一些茶叶提取物不仅会使高效液相色谱法检查农药残留出现干扰峰，增加定性、定量难度，还会增加高效液相色谱-串联质谱法的离子抑制效应。检测方法方面，目前茶叶农药残留检测方法有气相色谱法（GC）[2]、高效液相色谱法（HPLC）[3]、气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）[4]、高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）[5-9]。气相色谱法对于挥发性差、极性强、热不稳定的有机物检测存在一定局限性[6]，高效液相色谱法难达到农残检测要求的检出限，气相色谱法、高效液相色谱法可能会出现假阳性误判，需要质谱（MS）进一步确认[4]。基于以上，本研究选取15种茶叶种植中可能使用的农药，克服了茶叶提取物对高效液相色谱-串联质谱法的离子抑制效应，建立了一种准确、可靠的超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）。
1.1 试验材料
1.1.1 试验试剂。一般试剂包括乙酸（分析纯）、乙腈（色谱纯）、甲酸（色谱纯）、蒸馏水、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基键合硅胶吸附剂（C18）、石墨化碳黑（GCB）、无水乙酸钠、无水硫酸镁；
标准物质包括甲胺磷（CAS：10265-92-6）、灭多威（CAS：16752-77-5）、乙酰甲胺磷（CAS：30560-19-1）、多菌灵（CAS：10605-21-7）、甲萘威（CAS：63-25-2）、氧乐果（CAS：1113-02-6）、啶虫脒（CAS：135410-20-7）、乐果（CAS：60-51-5）、灭线磷（CAS：13194-48-4）、吡虫啉（CAS：138261-41-3）、噻虫嗪（CAS：153719-23-4）、除虫脲（CAS：35367-38-5）、三唑磷（CAS：24017-47-8）、丙溴磷（CAS：41198-08-7）、苯醚甲环唑（CAS：119446-68-3）等15种农药（农业农村部环境质量监督检验测试中心，1 000 mg/L）。
1.1.2 试验材料。试验材料包括0.5 mm玻璃均质子，20～200、100～1 000 μL 移液枪，15、50 mL CNW 塑料具塞离心管，一次性5 mL注射器，0.22 μm微孔亲水PTFE滤膜，2 mL进样瓶。
1.1.3 仪器及设备。具体有Waters Xevo TQ-S Micro超高效液相色谱-串联质谱仪（配ESI离子源）、高速组织粉碎机、电子天平（精确度为0.01 g）、涡旋混合器、离心机、超声波清洗机。
1.2 液相色谱-串联质谱仪检测条件
1.2.1 液相色谱条件。色谱柱类型为Waters BEH C18（2.1mm×100mm，1.7μm）；
柱温 40℃；
流速 0.4mL/min；
进样量1 μL；
流动相A为0.05%甲酸水溶液，流动相B为0.05%甲酸乙腈，梯度洗脱程序见表1。
表1 超高效液相色谱流动相梯度洗脱程序
1.2.2 质谱条件。电离模式为电喷雾，在正离子模式下扫描，毛细管电压为3000 V，离子源温度为350℃，去溶剂气流量为650 L/h，扫描模式为多反应监测模式（MRM）。
1.3 混合标准溶液配制
准确吸取0.2 mL各农药标准物质置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，混匀，置于-20℃冰箱中保存。
1.4 样品前处理方法
1.4.1 制备。取500g茶样，用粉碎机粉碎，过200 μm筛，充分混匀，密封并标识，置于阴凉干燥处保存。
1.4.2 提取。准确称取2 g茶叶样品于50 mL离心管中，加10 mL蒸馏水涡旋混匀，静置30 min；
加入3颗玻璃均质子和20 mL含1%乙酸的乙腈溶液，涡旋混匀2 min；
放入-20℃冰箱中冷冻10 min；
从冰箱取出后，加入含有1 g乙酸钠、4 g无水硫酸镁的混合萃取填料，剧烈振摇30 s至充分混匀，8 000 r/min离心5 min，待净化。
1.4.3 净化。吸取4 mL经1.4.2处理后的上清液于预先装有 200 mg PSA、200 mg C18、60 mg GCB、600 mg MgSO4混合净化填料的15 mL离心管中，剧烈振摇30 s后涡旋1 min，8 000 r/min离心5 min之后，吸取1.0 mL上清液过0.22 μm滤膜装进样瓶，待测。
2.1 方法优化
2.1.1 提取方法及流动相优化。提取溶剂的选择要考虑溶剂极性、农药特性和溶解性[10]。若茶叶含水量低于10%，在加入提取溶剂前需要加入适量水浸泡，浸泡后再用乙腈提取效率更高[7]。基于此，本试验中采用2 g茶叶样品添加10 mL蒸馏水涡旋混匀并静置30 min。茶叶组织间隙小，对提取溶剂的提取效率要求高。乙腈渗透率强，与水互溶，盐析作用下与水分离，能有效提取多种农药且对色素和油脂提取能力不强，添加少量酸可以减少部分农药的分解和调节pH值[8]，因而本研究采用1%乙酸乙腈作为提取溶剂。考虑茶叶提取物会增加UPLC-MS/MS离子抑制效应，在流动相中添加了0.05%甲酸。15种农药质谱参数优化结果见表2。
表2 15种农药质谱分析参数
2.1.2 净化条件优化。茶叶中含有糖类、茶多酚、咖啡碱、色素、脂肪酸等多种化合物，其中茶多酚类和色素类化合物含量较高[9]，前处理较其他农产品复杂。无水硫酸镁能吸附提取溶剂中残留的水分；
PSA能吸附茶多酚，去除脂肪酸和有机酸，但脱色效果一般；
C18能吸附糖类，有效去除低极性杂质和高级脂肪酸酯类[5]，但对茶多酚吸附效果不明显；
GCB能吸附叶绿素、咖啡碱，但对平面结构的农药有吸附作用。在考虑净化效果和保证回收率的前提下，采用了PSA、C18、GCB、MgSO4的混合净化填料来去除干扰物。
2.2 方法准确度及精密度
取1.3配制的混合标准溶液，用茶叶空白基质逐级稀释成标准曲线工作液，在0.02～0.50 mg/L浓度范围内，各目标化合物的浓度值与响应峰面积呈现较好的线性关系，标准工作曲线相关系数R2均大于0.99。按1.4前处理方法制作0.05、0.10、0.20 mg/kg 3个浓度水平的混合标准溶液进行回收试验，每个浓度设置6个平行。结果表明，各目标化合物的回收率为72.1%～109.9%，相对标准偏差（RSD）为1.0%～9.2%，详见表3。同时做样品空白试验，得出空白基质对15种目标化合物无干扰。本方法的准确度及精密度能够满足农药残留检测要求。
表3 15种农药的回收率及精密度（n=6）
本研究建立了UPLC-MS/MS法同时检测茶叶中15种农药残留。该方法样品前处理简单、耗时短、净化效果好、灵敏度高，回收率为72.1%～109.9%，相对标准偏差（RSD）小于10.0%，能够满足茶叶中农药残留检测要求。
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