近红外二区荧光活体成像在细胞示踪上的应用进展

李惠珠 陈 俊

（复旦大学附属华山医院运动医学科 上海 200040）

近红外（near-infrared，NIR）光因具有组织穿透性高、自发荧光信号低等特性［1］，被誉为 “治疗光” 、 “可见光” ，广泛应用于医疗领域中的诊断和治疗。近红外光即指波长为650~1 700 nm 的光，又分为近红外一区光（NIR-Ⅰ，650~9 00 nm）和近红外二区光（NIR-Ⅱ，900~1 700 nm）。NIR-Ⅱ相较NIR-Ⅰ具有更良好的组织穿透性，其本底荧光信号极低，分辨率较高，故有更好的应用前景［2］。NIR-Ⅱ成像的荧光纳米探针包括有机小分子荧光探针（smallmolecule dye，SMD）、量子点（quantum dots，QDs）探针、稀土纳米粒子（rare earth-doped nanoparticles，RENPs）探针、单笔纳米碳管（single-walled carbon nanotubes，SWCNTs）探针等［3］。各类探针具有各自的特点及优势，SMD 在网状内皮系统中摄取较少，有较好的临床应用前景，肿瘤细胞示踪多使用此类型探针；
量子点相对分子质量小且因量子产率高（>10%），荧光信号佳，现为研究热点［4］。随着影像学的发展，生物成像的分辨率与疾病诊断能力逐渐上升，但传统的X 线、CT、MRI 等均用于记录生物体某一时刻的断层成像，在动态观测方面尚有欠缺［5］，而NIR-Ⅱ光因有望弥补上述不足，近年来被用于生物体活体动态成像技术，包括血管成像、神经成像、细胞示踪成像等［6］。

细胞作为各器官发挥功能的基本单位，其运动在许多生理及病理生理过程中起着关键作用，如免疫监督、组织修复等［7］。探究生物体内细胞运动有助于更好地理解疾病的发生机制、演变过程、不同治疗方法的疗效及其机制。近年来发展迅速的免疫治疗、再生医学治疗等均需监测治疗用细胞的运动轨迹，确认是否定位准确并起到治疗作用，确定最优给药浓度及给药时间［8］。最初的细胞示踪主要通过观察组织学切片，但生物体内存在复杂的内环境调节机制，而组织切片无法表现动态过程［9］。改良的细胞示踪方法结合了传统的成像方法，如CT、正电子发射断层成像技术（positron emission tomography，PET）等，主要利用纳米粒子如纳米铜、18F-FDG（18F-flurodeoxyglucose）等标记细胞进行成像，而这些方法因仍无法动态成像、对部分细胞的标记困难、放射性污染等原因限制了其应用［10］。被广泛应用的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记法因组织穿透性低且本底荧光高而限制了其在活体组织成像中的应用［11］。NIR-Ⅱ荧光成像弥补了上述不足，无放射性危险且细胞毒性较小，拥有高组织穿透性及极低本底荧光，故此项技术以活体动态成像作为最大的亮点及优势［1］，在细胞示踪技术上有巨大的应用潜力。

NIR-Ⅱ荧光成像的应用研究正逐步多样化，但其在活体细胞示踪上的应用作为医学进入 “精准化” 后的一个新兴领域，尚处于初步研究阶段。近年来开展了许多细胞示踪的研究，但尚缺乏对此类研究的总结，故本文主要对于近红外二区荧光成像在肿瘤细胞、干细胞等不同细胞示踪中的应用进行综述，并对未来研究进行展望。

肿瘤细胞肿瘤常年居于全球死亡病因首位［12］，而肿瘤细胞的转移为关键性危险因素，包括血行转移、淋巴转移［13］等。现有影像学技术无法发现的手术后残余病灶及各种转移病灶影响肿瘤的治疗效果及患者预后，故在微观层面监测肿瘤细胞有迫切的需求。利用NIR-Ⅱ光的肿瘤细胞荧光成像不仅能在微观层面追踪肿瘤细胞，还能通过光热效应杀灭肿瘤细胞［14］。

肝癌细胞 肝癌细胞的示踪涉及基础研究与临床研究。基础研究方面，Yan 等［15］构建的牛血清白 蛋 白CuS@BSA-RGD（bovine serum albumin，BSA）纳米粒子静脉注射后可定位至原位肝细胞癌病灶，其中精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸环可使粒子定位至肝癌细胞的整合素受体αvβ3/αvβ5，其在NIR-Ⅱ光下有较强信号并在24 h 时达到顶峰。有研究将RGD 肽、吲哚菁绿（indocyanine green，ICG）结合红细胞，得到多模式化的红细胞探针，通过静脉注射进入体内后10 h 可以有效定位至皮下肝癌小鼠模型的肿瘤病灶，并实现NIR-Ⅱ成像指导的外科肿瘤与转移淋巴结切除手术，病理结果证实在注射后10~13 h 内的切除效果良好［16］。而Hu 等［17］首次将NIR-Ⅱ成像技术用于临床研究中，使用ICG 作为探针静脉注射入23 例患者体内，平均4 天后进行开腹肝细胞癌病灶切除术。术中同时使用NIR-Ⅰ与NIR-Ⅱ成像技术进行辅助，通过病理学验证。结果表明二者均可探测超声与外科医师未能发现的肝细胞癌原位病灶与转移病灶，其中NIR-Ⅱ成像的敏感性更高，可发现被NIR-Ⅰ所忽略的病灶，且几乎不受手术室内其他光源影响，进一步肯定了NIR-Ⅱ技术在临床应用上的可能性与有效性。

乳腺癌细胞 有研究构建了多功能粒子命名为FIP-99mTc［18］，同时支持MRI 成像（含Fe3O4）、近红外二区成像（含IR-1061 有机染料）、SPECT/CT 成像（含99 mTc）、光热疗法等多种成像和治疗，且对细胞没有明显毒性。将此粒子注射入小鼠乳腺癌肿瘤病灶后，NIR-Ⅱ光照射下转移的淋巴结病灶中可以发现荧光信号，并在2 h 时达到顶峰。不仅如此，此粒子在808 nm 治疗激光的照射下可以通过光热效应有效杀灭肿瘤细胞。但因无法保证所有肿瘤原病灶内细胞被标记，故存在一定的漏诊率。另一种用于示踪小鼠乳腺癌（4T1）细胞的方法为，使用肿瘤细胞膜（含CD47 抗原）包被Ag2Te 量子点，注射后24 h 肿瘤病灶内的信号（1 300 nm）可达顶峰［19］。

噻吩并［3，4-B］噻吩（Thieno［3，4-b］thiophene，TT）连接复数噻吩链得出的TT-3T CP也可以用于标记该细胞，在细胞与探针共培养后12 h 荧光信号达到最高。研究中通过体外标记乳腺癌细胞后注射入小鼠皮下实现体内示踪，癌细胞荧光信号可在皮下持续存在至注射后10 天［20］。但因探针在体内标记乳腺癌细胞的效果未得到实验证实，缺乏临床意义，此探针更适合用于静脉注射后的微血管成像及淋巴结成像。而对于人乳腺癌细胞展开的研究较少，仅体外细胞实验证明，可以使用修饰后的Ag2S 量子点［21］或人工合成的聚合物pDA［22］连接西妥昔单抗，去结合细胞表面的表皮生长 因 子 受 体（epidermal growth factor receptor，EGFR）达到示踪目的，但EGFR 的特异性不强等原因限制了其应用。

人宫颈癌细胞（HeLa 细胞） 静脉注射的粒子如何定位到肿瘤细胞是一个难题，而HeLa 细胞作为拥有强大繁殖能力的肿瘤细胞株，被广泛用于研究。Wei 等［23］在HeLa 细胞模型小鼠中使用透明质酸（hyaluronic acid，HA）作为配体，将其连接到噻吩与异靛蓝衍生物结合的聚合物，形成纳米粒子，此粒子可以在静脉中随血液循环，结合到HeLa 细胞高表达的HA 受体CD44，从而定位肿瘤病灶，且1 064 nm 波长NIR-Ⅱ光下可使局部温度达到60.3 ℃。HA 受体并非HeLa 细胞特有，其具有被用到其他肿瘤细胞追踪的可能性。同时，有研究通过靶向线粒体，实现了NIR-Ⅱ光下肿瘤病灶的可视化。被命名为T-IPIC 的纳米粒子（nanoparticles，NPs）含有可定位至线粒体的三苯基鏻（triphenylphosphonium，TPP），静脉注射48 h 后在肿瘤部位高表达，并维持较高信号至96 h。该粒子在（1 000±10）nm 光照范围下有良好的成像功能，在808 nm 光下有最佳的光热效应和光动力学效应［24］。叶酸（folic acid，FA）作为HeLa 细胞靶向配体的有效性也得到了实验证明。Jeong 等［25］将 聚 合 物 包 被 的PbS/CdS core/shell 量子点与叶酸进行连接，构建FA-PQDs（1 280 nm）和普通PQDs（1 080 nm），并比较了肿瘤病灶内二者聚集性的差异，结果提示FA-PQDs 在肿瘤成像方面有更高的信噪比，且FA 可以帮助量子点定位至肿瘤。

结肠癌细胞 肿瘤细胞所表达的受体常被用于免疫治疗靶点，其中PD-L1 表达于多种肿瘤细胞，而其单抗的使用也已非常成熟［26］，故高表达PDL1 的肿瘤细胞可以使用NIR-Ⅱ成像技术进行示踪。Wan 等［27］在小鼠结肠癌细胞（MC38）模型中将PD-L1 的抗体连接到IR-BGP6 荧光团，形成PD-L1-BGP6，静脉注射后24 h 在肿瘤病灶达到信号顶峰（1 200 nm），并在10 天内通过肾脏快速排泄。此方法在活体状态下比较PD-L1 表达量的差异，监测了PD-L1 单抗治疗肿瘤的效果。因PD-L1 在其他肿瘤细胞中也有较多表达，有望被用于MC38 结肠癌细胞之外的其他肿瘤细胞的标记。有研究使用了新合成肽介导的CP⁃IRP 纳米探针，靶向结合肿瘤细胞高表达分子CD133，能够活体标记并观察人结肠癌细胞。该探针在6 h 内肾脏去除率达80%，具有较高的安全性，也可以对尿道进行直观的显像。

其他癌细胞 有研究构建了肽类化合物DUPAaFFC 作为可特异性识别前列腺癌细胞膜抗原（prostate specific membrane antigen，PSMA）的探针，连接到荧光纳米粒子后结合NIR-Ⅱ光和电感耦合等离子体质谱，用于监测血液中是否含有过量PSMA 及表达PSMA 的细胞数目［28］。结合GD2 抗体，金纳米粒子（gold nanoparticle，GNP）的纳米碳管（single-wall carbon nanotube，SWCNT）可作为探针有效标记黑色素瘤细胞，在1 100 nm NIR-Ⅱ光下能够进行双光子显像观察肿瘤病灶，体外实验证明在980 nm 光激发下实现了100%的黑色素细胞杀伤率［29］。另外，有些探针可以用于标记多种肿瘤细胞，CD44 在胰腺癌、乳腺癌、脑胶质瘤细胞中均有表达，利用P-选择素作为配体构建的BLIPO-1048 拥有结合至CD44 受体的能力，可以标记上述细胞且不会被巨噬细胞快速清除，1 064 nm 光下通过光声成像可直观观察肿瘤病灶［30］，同时具有光热效应。

干细胞干细胞为具有多向分化功能的细胞，使用干细胞的细胞治疗法有望成为治疗许多疾病的有力手段，包括肝脏疾病、心血管疾病、神经系统疾病、肾脏疾病、杜氏肌营养不良等，而移植或注射后干细胞的运动须严密监测，以确定其具体疗效、最优剂量及潜在风险等［31］。

内皮祖细胞 内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）作为能自我更新、增殖分化为内皮细胞的多能干细胞，被用于治疗组织缺血性疾病，其可通过分化为成熟的内皮细胞，促进缺血组织的血管再生［32］。Lim 等［33］使用共轭二苯并环辛炔（DBCOCy5）对EPCs 进行标记后局部注射到后肢血管损伤模型小鼠的病灶以观察细胞对血管再生的影响。标记完成的细胞具有良好的原始功能，使用荧光分子断层成像技术（fluorescence molecular tomography，FMT）与多普勒激光可以直观地观察到EPCs 的去向、滞留时间及血管新生，为使用干细胞治疗缺血性疾病提供了有效的监测方法。

间充质干细胞 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）为目前临床中研究最多的一类干细胞，被用于各类免疫性疾病、心力衰竭、克罗恩病导致的肠瘘等疾病的治疗［34］，而治疗用MSCs 的体内监测对细胞治疗法有重大意义。使用PbS 量子点标记MSCs（峰值1 300 nm），局部注射至冈上肌损伤小鼠模型的关节腔内，在NIR-Ⅱ光下可以动态观察到细胞在损伤部位的聚集、滞留时间、排出时间及排出途径等［35］，研究表明关节腔注射后干细胞会逐步移动到损伤部位肩袖足印处，这可以为探究MSCs 治疗机制及优化细胞疗法提供有力的工具。

有研究提出了使用有机半导体聚合物纳米探针（organic semiconducting polymer-based nanoprobe，OSPNs+）示踪人MSCs 的方法，将标记的细胞分别注射入小鼠皮下和颅内，1 064 nm NIR-Ⅱ下的成像结果比传统NIR-Ⅰ光成像具有更好的显像功能，且通过光声成像可以更直观地观察到细胞的分布位置［36］，但暂未进行细胞治疗作用的研究。MSCs 还被应用于皮肤创伤的修复。Chen 等［37］使用Ag2S 量子点标记MSCs，探究其修复皮肤创面情况，静脉注射后MSCs 绝大部分聚集于肺及肝脏，12 h 后逐渐聚集到创口边缘，当创面添加基底细胞衍生因子（stromal cell-derived factor-1a，SDF-1a）后4 h 细胞即开始聚集到创口边缘，并发挥修复作用。

肌源性干细胞 铁酸铋谐波纳米颗粒（bismuth ferrite harmonic nanoparticles，BFO HNPs）可被用于标记肌源性干细胞（muscle-derived stem cells，MDSCs），体外细胞实验表明其未对细胞的性能及形态产生影响，且具有较高信噪比，但细胞的聚集性有所下降。标记的细胞在局部肌肉注射后24 h仍存留在肌肉中［38］，有望用于治疗杜氏肌营养不良，但具体治疗效果及机制有待在疾病动物模型中进一步探究，尽管使用的激发光是1 300 nm NIR-Ⅱ光，其肌肉组织穿透深度1 mm 的特性在一定程度上限制了活体成像应用。

其他细胞除上述大类外，还有NIR-Ⅱ荧光成像示踪若干不同种类细胞的报道，反映该技术对多种细胞均适用，有强大的潜在应用价值。

免疫细胞 免疫细胞作为人体中承担防御，监测及杀伤工作的重要细胞，其功能的正常发挥对于机体有重要作用，故对细胞运动有实时监测的必要性。目前NIR-Ⅱ荧光成像在免疫细胞中的研究主要集中在其对肿瘤性疾病的治疗作用。通过使用Ag2Se（λ=1 350 nm）量子点标记自然杀伤（natural killer，NK）细胞，可在波长1 050 nm 的NIR-Ⅱ光照下显示NK 细胞的分布情况。注射NK 细胞前通过Ag2S（λ=1 050 nm）标记NK 细胞的趋化因子及化疗药物，提前静脉输送至肿瘤病灶可显著提高NK 细胞定位肿瘤的效率［39］。除NK 细胞外，Yu 等［40］通过近乎无创的方法监测了体内骨髓来源抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）的分布。通过使用两种非重合波长的NIR-Ⅱ（NIR-Ⅱa 和NIR-Ⅱb）量子点探针分别包被MDSCs 的两种标志性抗体，尾静脉注射入体内后利用两种NIR-Ⅱ光影像的重叠精准描绘了MDSCs 在小鼠体内和肿瘤中的分布，同时可比较治疗前后MDSCs 的量及分布情况。研究表明肿瘤微环境内MDSCs 越少，免疫检查点阻断治疗的效果越好［41］，这对提高免疫检查点阻断法治疗肿瘤的有效性有重大意义。

卵巢颗粒细胞 卵巢颗粒细胞等生殖腺内细胞可利用受体与配体结合的原理来进行NIR-Ⅱ光下示踪。为研究促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，FSH）的受体细胞，Feng 等［42］使用荧光探针CH1055 标记FSH，通过尾静脉注射定位至小鼠卵巢与睾丸中拥有FSH 受体的细胞，共聚焦荧光显微镜下可以获得精准的影像。除此之外，也可以通过此项方法无创定位破骨细胞［43］。

成纤维细胞 Yang 等［44］提出过较为简便的、基于Ag2Te的一站式探针合成方法，粒子发射光波长为995~1 068 nm，有较小表面涂层厚度（1.5~1.9 nm）。Ag2Te 量子点具有较高光稳定性、胶体稳定性和极低的细胞毒性，能够有效标记小鼠成纤维细胞。但此项技术仅有体外细胞实验的证据，有待进一步体内实验的确认。

结语NIR-Ⅱ荧光成像以活体动态成像作为最大的优点及特点，在细胞示踪技术上的应用目前集中于肿瘤细胞与干细胞，使用量子点、有机纳米粒子等对细胞进行标记后，通过局部或静脉注射入体内，而静脉注射途径通常使用粒子包被细胞特异性抗体的方法进行靶向定位。NIR-Ⅱ荧光成像有巨大的应用潜力，同时有一定的不足，实际应用还需进一步探究。

首先，NIR-Ⅱ成像技术本身具有进一步提升的需求与可能性，包括荧光探针的优化和分辨率的提高。探针的优化需要荧光强度和特异性的提升，故进一步研究可致力于研发具有高荧光性能与低生物毒性的新材料，并对目前材料进行修饰，从而提高探针的靶向性能。在分辨率方面，目前的NIR-Ⅱ荧光成像技术虽可以示踪细胞，但未达到真正的微观成像。通过结合显微层面上的成像技术、改善发光材料的性能、提高细胞与材料的结合方式等方法，可提高成像的分辨率。其次，NIR-Ⅱ荧光成像技术示踪细胞的应用领域有待开拓与丰富，将其应用于更多种类的细胞。此技术有临床应用的先例，可积极向临床应用方向进行探索。在目前最受关注的肿瘤应用方面，可进一步探究其辅助外科手术的可行性，而鉴于目前所用为非特异性探针，临床应用中可探究不同探针的灵敏度与特异性，寻找各类疾病中最适合使用的探针。另外，在细胞治疗与组织工程方面也有进一步拓展应用的必要性。各类细胞治疗的体内监测相关研究有助于优化治疗剂量、治疗时间窗。而近年来附有生长因子及MSCs 的生物支架、人工韧带等组织工程生物材料在医学领域中受到关注，虽然其有效性通过组织学得到了认证，但是具体治疗机制不详，影响了实际临床应用及产品化，故可在NIR-Ⅱ光下探究上述材料所负载干细胞的具体移动路径及其治疗作用，帮助优化一系列人工器官替代产品的设计理念和方法。

作者贡献声明李惠珠 论文构思和撰写。陈俊 论文构思和审校。

利益冲突声明所有作者均声明不存在利益冲突。

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