苍耳亭抗大鼠肺癌机制研究

孔顺，王菲菲，张少楠，张叶明

（芜湖市第二人民医院，安徽芜湖 241000）

肺癌是呼吸系统常见的恶性肿瘤，临床上有较高的发病率和死亡率，且呈现逐年上升的趋势，对患者生命造成严重的威胁[1]。目前，临床根治肺癌的唯一方法是手术切除，但对于不适合行手术切除的患者，其化疗、放疗疗效尚不能令人十分满意。因此，寻求一种可重复、创伤小、便捷的治疗方法是目前具有重要意义的策略。越来越多的研究表明，中药单体化合物由于其易合成、毒副作用较低、疗效稳定等特点，有望成为未来抗肿瘤理想的药物。苍耳子为菊科植物苍耳Xanthium sibiricumPatr.干燥成熟带总苞的果实，味甘，性温，入肺、肝经，可祛风湿、通鼻窍，主治风湿痹痛、头痛鼻渊、皮肤痒疹、麻风病，主要含有水溶性苷类、倍半萜内酯类、挥发油类、脂肪油类、酚酸类及其他化合物，有降血糖、抗过敏、抗菌、抗炎、镇痛、抗肿瘤的药理作用[2]。苍耳亭（Xanthatin）为苍耳的主要活性成分之一，属于苍耳属植物中倍半萜内酯类化学成分[3]。有研究表明，苍耳亭对非小细胞肺癌的生长存在显著的抑制作用，且对正常肺上皮细胞生长影响较小[4-5]。提示其可能成为具有高效低毒特点的抗肺癌候选药物，但其作用机制尚不完全明确。有研究发现，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）/真核细胞翻译起始因子4E（eIF4E）结合蛋白1（4E-BP1）信号通路在细胞的生存、生长与增殖中起中心调控作用，该信号通路的传导异常与多种恶性肿瘤有关[6]，已成为肿瘤治疗的新靶点。为进一步明确苍耳亭的抗肺癌的作用及机制，本研究构建了荷Lewis肺癌大鼠模型，观察苍耳亭对肺癌大鼠肿瘤、能量代谢及mTOR/4E-BP1信号通路的影响，现将研究结果报道如下。

1.1 实验动物40只清洁级雄性大鼠，体质量（180±20）g，购自常州卡文斯实验动物有限公司，许可证号：SCXK（苏）2016-0003。在实验室适宜温湿度的环境中对大鼠适应性喂养7 d，自由饮水摄食。

1.2 药物、试剂与仪器苍耳亭，购自南京世洲有限公司，分子结构见图1，纯度98.5%，批号：26791-73-1，使用前用二甲基亚砜（DMSO）配制，存于-20℃冰箱中备用。mTOR抗体、磷酸化（p）-4E-BP1抗体（美国Abcam公司）；
三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、一磷酸腺苷（AMP）（美国Sigma公司）；
线粒体膜电位（MMP）检测试剂盒（JC-1法）（上海碧云天生物技术有限公司）。GTR16-2型冷冻离心机（北京时代北利离心机有限公司）；
DMI3000B倒置显微镜（德国Leica公司）；
TC-100B恒温摇床（上海领成生物科技有限公司）；
E2695-2489高效液相色谱仪（美国Waters公司）。

图1 苍耳亭化学结构Figure 1 Chemical structure of Xanthatin

1.3 动物造模大鼠Lewis肺癌细胞（购自美国ATCC公司），于37℃、5%CO2培养箱中以含10%胎牛血清的高糖培养基培养，14 d后取生长状态最佳的细胞，用生理盐水调节其密度为5×106个/mL，以每只0.2 mL在大鼠右腋下接种。接种7 d后，造模大鼠右腋下可触及瘤块。测量瘤体质量和体积。40只大鼠在10 d后均成瘤，提示肺癌模型制备成功。

1.4 动物分组与给药将40只成模大鼠随机分为模型组，苍耳亭低、中、高剂量组，每组10只。模型制备成功后第2天开始进行给药干预：模型组给予等体积的生理盐水灌胃；
苍耳亭低、中、高剂量组大鼠分别给予10、20、40 mg/kg苍耳亭灌胃。每天给药1次，连续给药14 d。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 苏木素-伊红（HE）染色观察肺癌组织病理形态 取大鼠肺癌组织，4%多聚甲醛固定，脱水后石蜡包埋，切片（厚度为5μm）。每组取3张切片，常规脱蜡至水，苏木素染色1 min，自来水冲洗切片1 min，盐酸-酒精分色3 s，流水冲洗5 min，伊红染色10 s，梯度酒精上行脱水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各20 min，中性树胶封片。光学显微镜下观察。

1.5.2 末端脱氧核苷酸转移酶介导的d UTP缺口末端标记（TUNEL）法测定肺癌细胞凋亡率 取“1.5.1”项切片，经脱蜡、梯度乙醇溶液浸泡后，参照TUNEL染色试剂盒说明书的步骤进行染色，经漂洗、脱水、透明后，用中性树胶封片，光学显微镜下观察切片并拍照，每个切片随机选取5个视野。

1.5.3 高效液相色谱法（HPLC）检测肺癌组织中ATP、ADP和AMP含量 取大鼠肺癌组织，加入0.4 mol/L冰预冷的高氯酸（肺癌组织∶高氯酸=1∶5），采用超声粉碎机粉碎、制成匀浆。于4℃、10 000 r/min离心（离心半径6.2 cm）10 min，取上清液100μL，加入1 mol/L碳酸钾与甲醇混合液（体积比4∶1）中和高氯酸50μL。于4℃、10 000 r/min（离心半径6.2 cm）离心10 min，取上清液100μL加水100μL稀释，应用HPLC仪检测。色谱柱：Phenomenex Luna C18柱；
进样量：20μL；
柱温：室温；
样品温度：4℃；
检测波长：254 nm；
流动相A：磷酸二氢钠溶液；
流动相B：甲醇。

1.5.4 JC-1法检测肺癌组织MMP水平 组织线粒体的分离及JC-1染色工作液的配制均按照试剂盒说明书操作。JC-1染色缓冲液将染色工作液稀释成原来的5倍，在稀释后的JC-1染色工作液中加入纯化的线粒体。在MMP较高时，产生红色荧光，JC-1为聚合物；
MMP较低时，产生绿色荧光，JC-1为单体。MMP水平的变化情况可通过荧光颜色的变化来进行观察。采用流式细胞仪分别测定单体和聚合物的值，以聚合物与单体的比值表示MMP水平。

1.5.5 蛋白质免疫印迹（Western Blot）法检测肺癌组织中mTOR、p-4E-BP1蛋白表达 取肺癌组织置于冰上，剪碎放入研磨器中，加入200μL蛋白裂解液和2μL PMSF，冰上研磨1 min直至充分裂解。以14 000 r/min离心（离心半径10 cm）10 min得到上样缓冲液，用二喹啉甲酸（BCA）法测定上样缓冲液中总蛋白浓度。将样品稀释到20μL相同浓度，加入4μL上样缓冲液，混匀后煮沸5 min。加入电泳缓冲液至电泳槽中，稳定电压80 V电泳。电泳结束后，将分离的蛋白条带转印至转移膜上。封闭，在封闭液中放入转移膜，置于37℃恒温摇床上，低速摇动2 h。分别加入TBS稀释的一抗mTOR、p-4E-BP1（1∶2 000稀释），内参β-actin（1∶2 000稀释）4℃过夜。洗膜后加辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）二抗（1∶10 000稀释），室温摇床反应2 h。TBS洗涤后，滴加化学发光试剂，曝光，拍摄蛋白显影条带，应用ImageJ软件分析目的蛋白相对表达量。

1.6 统计方法采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，所有计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，用t检验比较2组的差异性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 各组大鼠瘤体质量和体积比较与模型组比较，苍耳亭低、中、高剂量组大鼠瘤体的质量和体积均显著减小（P＜0.05），且随剂量增加呈逐渐递减趋势，其中，高剂量组瘤体质量和体积降低最为明显。见表1。

表1 各组大鼠瘤体质量和体积比较Table 1 Comparison of mass and volume of tumor body between various groups of rats（±s）

表1 各组大鼠瘤体质量和体积比较Table 1 Comparison of mass and volume of tumor body between various groups of rats（±s）

①P＜0.05，与模型组比较；
②P＜0.05，与苍耳亭低剂量组比较；
③P＜0.05，与苍耳亭中剂量组比较

组别模型组苍耳亭低剂量组苍耳亭中剂量组苍耳亭高剂量组F值P值鼠数/只10 10 10 10瘤体质量/g 20.5±3.2 15.8±2.8①11.3±3.4①②8.4±4.1①②③24.152＜0.001瘤体体积/mm3 5012.3±310.2 3520.1±266.1①2763.5±276.4①②2071.4±296.5①②③192.007＜0.001

2.2 各组大鼠肺癌组织病理形态学变化比较模型组和苍耳亭低剂量组大鼠肺组织可观察到细胞形态大小不一，且排列无规则，有明显的癌巢出现，细胞分化差，核大深染，多见核分裂相，且肺组织形态破坏严重；
苍耳亭中剂量组和高剂量组未见明显癌巢，肺组织形态完整，细胞形态均一、分化较好，且苍耳亭高剂量组肺组织情况优于中剂量组。结果见图2。

图2 各组大鼠肺癌组织病理形态学变化比较（HE染色，×200）Figure 2 Comparison of pathologicalchanges of lung tissues between various groups of rats（by HE staining，×200）

2.3 各组大鼠肺癌细胞凋亡情况比较模型组，苍耳亭低、中、高剂量组均可见凋亡细胞散在于癌细胞之间，胞浆减少，核内可见棕黄色颗粒物质，呈核碎裂、核固缩，或核溶解现象。见图3。与模型组比较，苍耳亭低、中、高剂量组的细胞凋亡指数均明显增加（P＜0.05），且随剂量增加呈逐渐递增趋势，其中，苍耳亭高剂量组细胞凋亡指数明显高于低剂量组和中剂量组（P＜0.05）。结果见表2。

2.4 各组大鼠肺癌组织ATP含量及ADP/ATP、AMP/ATP值比较与模型组比较，苍耳亭低、中、高剂量组大鼠ATP含量显著降低，ADP/ATP、AMP/ATP比值均显著升高（P＜0.05），且随剂量增加效果越强，其中苍耳亭高剂量组ATP含量显著低于低、中剂量组（P＜0.05），ADP/ATP、AMP/ATP比值显著高于低、中剂量组（P＜0.05）。结果见表3。

2.5 各组大鼠肺癌组织MMP水平比较与模型组比较，苍耳亭低、中、高剂量组肺癌组织MMP水平均明显降低（P＜0.05），且随着苍耳亭剂量增加呈逐渐递减趋势，苍耳亭高剂量组肺癌组织MMP水平低于低、中剂量组（P＜0.05）。见表4。JC-1荧光图像结果显示：模型组绿色荧光明显减弱，红色荧光明显增强；
苍耳亭低、中、高剂量组绿色荧光逐渐增强，红色荧光逐渐降低。结果见图4。

图3 各组大鼠肺癌细胞凋亡情况（TUNEL染色，×200）Figure 3 Apoptosis of cancer cells between various groups of rats（by TUNEL staining，×200）

表2 各组大鼠肺癌细胞凋亡指数比较Table 2 Comparison of apoptosis index of lung cancer cells between various groups of rats（±s）

表2 各组大鼠肺癌细胞凋亡指数比较Table 2 Comparison of apoptosis index of lung cancer cells between various groups of rats（±s）

①P＜0.05，与模型组比较；
②P＜0.05，与苍耳亭低剂量组比较；
③P＜0.05，与苍耳亭中剂量组比较

组别模型组苍耳亭低剂量组苍耳亭中剂量组苍耳亭高剂量组F值P值鼠数/只10 10 10 10凋亡指数（AI）/%2.4±0.8 5.6±1.2①14.7±2.5①②28.3±3.7①②③244.517＜0.001

2.6 各组大鼠肺癌组织中mTOR、p-4E-BP1蛋白表达比较与模型组比较，苍耳亭低、中、高剂量组大鼠肺癌组织mTOR、p-4E-BP1蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05），随着苍耳亭剂量增加呈逐渐递减趋势，且高剂量组降低最为显著（P＜0.05）。结果见图5。

表3 各组大鼠肺癌组织三磷酸腺苷（ATP）含量及二磷酸腺苷（ADP）/ATP、一磷酸腺苷（AMP）/ATP比值比较Table 3 Comparison of ATP content and ADP/ATP and AMP/ATP ratios in lung cancer tissues between various groups of rats（±s）

表3 各组大鼠肺癌组织三磷酸腺苷（ATP）含量及二磷酸腺苷（ADP）/ATP、一磷酸腺苷（AMP）/ATP比值比较Table 3 Comparison of ATP content and ADP/ATP and AMP/ATP ratios in lung cancer tissues between various groups of rats（±s）

①P＜0.05，与模型组比较；
②P＜0.05，与苍耳亭低剂量组比较；
③P＜0.05，与苍耳亭中剂量组比较

组别模型组苍耳亭低剂量组苍耳亭中剂量组苍耳亭高剂量组F值P值鼠数/只10 10 10 10 ADP/（ng·mg-1）293.4±28.7 425.1±37.2①458.3±36.4①②519.2±47.1①②③63.290＜0.001 ATP/（ng·mg-1）127.6±36.2 101.2±26.5①80.4±20.1①②65.7±12.4①②③14.537＜0.001 AMP/（ng·mg-1）319.1±32.5 323.8±29.2①369.8±30.1①②413.9±22.3①②③23.910＜0.001 ADP/ATP比值2.3±0.8 4.2±1.4①5.7±1.8①②7.9±2.1①②③15.393＜0.001 AMP/ATP比值2.5±0.9 3.2±1.1①4.6±1.5①②6.3±1.8①②③15.004＜0.001

表4 各组大鼠肺癌组织线粒体膜电位（MMP）水平比较Table 4 Comparison of MMP levels in lung cancer tissues between various groups of rats（±s）

表4 各组大鼠肺癌组织线粒体膜电位（MMP）水平比较Table 4 Comparison of MMP levels in lung cancer tissues between various groups of rats（±s）

①P＜0.05，与模型组比较；
②P＜0.05，与苍耳亭低剂量组比较；
③P＜0.05，与苍耳亭中剂量组比较

组别模型组苍耳亭低剂量组苍耳亭中剂量组苍耳亭高剂量组F值P值鼠数/只10 10 10 10 MMP 431.2±50.6 187.5±41.3①87.9±36.2①②51.7±20.5①②③195.100＜0.001

本研究以肺癌模型大鼠为研究对象，以苍耳亭干预可显著降低肺癌大鼠瘤体质量和体积，改善肺癌组织病理形态，使癌巢消失，增加肺癌细胞凋亡指数，且随着苍耳亭浓度的增加，效果越显著，提示苍耳亭可有效抑制肺癌的生长。

氧化磷酸化是细胞能量代谢的主要途径之一，肿瘤细胞在不断增殖的过程中能生成大量三磷酸腺苷（adenosine triphosphates，ATP），可为其持续生长提供能量[7]。因此，欲抑制肿瘤细胞的增殖可先抑制其能量的生成。ATP及其代谢产物二磷酸腺苷（ADP）和一磷酸腺苷（AMP）的浓度是描述细胞代谢的主要参数，可直接反映机体能量代谢水平的高低[8]。本研究结果显示，苍耳亭可降低大鼠肺癌组织ATP的含量，增加肺组织ADP/ATP比值和AMP/ATP比值。ATP合成减少则肿瘤细胞能量代谢水平减弱，获能减少，提示苍耳亭可能通过抑制肺癌细胞能量代谢发挥抗肺癌作用。

图4 各组JC-1荧光图像比较（JC-1染色，×400）Figure 4 Comparison of JC-1 fluorescence images between various groups（by JC-1 staining，×400）

图5 各组大鼠肺癌组织中mTOR、p-4E-BP1蛋白表达比较Figure 5 Comparison of mTOR and p-4E-BP1 protein expression in lung cancer tissues between various groups of rats

线粒体膜电位（MMP）的正常是维持线粒体进行氧化磷酸化的先决条件[9]。线粒体是由双层膜包被的囊状结构，外膜有较高通透性，内膜则通透性低，但这种不通透性对ATP的生成和MMP的维持起重要作用[10]。MMP是线粒体在氧化呼吸过程中内膜两侧离子浓度不同所产生的跨膜电位差，MMP的稳定有利于维持细胞的正常生理功能，MMP异常可导致线粒体膜的功能和状态发生改变，从而影响线粒体进行氧化磷酸化，使细胞能量代谢异常[11-12]。本研究结果显示，苍耳亭能下调大鼠肺癌组织MMP，随着苍耳亭浓度的升高，MMP下降越显著。MMP降低，则膜电位的电势能降低，ATP的合成亦减少。提示苍耳亭可通过降低MMP，减少肺癌细胞的ATP合成，从而抑制肺癌生长。

已有研究表明，苍耳亭能通过诱导糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）磷酸化失活引发细胞周期阻滞及凋亡[5]。研究发现，mTOR/4E-BP1是GSK-3β上游的信号通路，激活其信号通路可介导细胞增殖，且与多种癌症密切相关[13-14]。mTOR是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，激活状态的mTOR可以磷酸化真核细胞下游的关键翻译因子4E-BP1[15]。mTOR/4E-BP1通路调节功能的异常与人类恶性肿瘤的发展密不可分。当肿瘤细胞内mTOR/4E-BP1被激活，可使肿瘤细胞增殖失控、凋亡抗拒，从而引起肿瘤细胞的代谢改变[16]。本研究结果显示，苍耳亭可下调大鼠肺癌组织mTOR和p-4E-BP1蛋白表达水平，且随着苍耳亭浓度的增加，其对mTOR和p-4E-BP1蛋白的抑制效果越显著，表明苍耳亭可通过抑制肺癌组织mTOR/4E-BP1信号通路的活化，起到抗肺癌的作用。

综上所述，祛风解表苍耳子的主要活性成分苍耳亭可通过降低癌细胞能量代谢，抑制癌细胞mTOR/4E-BP1信号通路的活化，抑制大鼠肺癌。

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