东莨菪内酯胶束的大鼠在体胃肠吸收动力学研究*
时间：2022-12-03 14:05:04 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
马 宇，杨证玉，何宝红，毛家敏，曾迎春△
1.成都医学院 药学院(成都 610500)；
2.成都医学院 结构特异性小分子药物研究四川省高校重点实验室(成都 610500)
东莨菪内酯(7-羟基-6-甲氧基香豆素，Scopoletin，Sco)属于一种香豆素类化合物，在植物中分布广泛，具有多种药理活性[1]。研究[2]表明，Sco既可抑制高尿酸血症模型小鼠肝脏中尿酸的产生，又能促进肾脏对尿酸的排泄，显示出良好的抗痛风潜能。由于Sco溶解性差且在体内易被代谢，口服生物利用度低(约6%)[3]，限制了该药的成药性。为提高Sco的口服生物利用度，笔者在前期研究[4-5]中，利用制剂手段，以聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇(Soluplus)为载体材料，成功制备了Sco-Soluplus口服胶束给药系统(Sco micelles，Sco-Ms)，并对其进行了体内外表征，结果表明，Sco-Ms提高了Sco的口服吸收和体内组织分布浓度，增强了Sco的体内抗痛风疗效。本实验拟建立测定灌流样品中Sco含量的高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法，通过在体原位胃灌注模型以及在体单向肠灌流模型，考察Sco及Sco-Ms在胃肠道中的吸收情况，为Sco口服给药系统的开发奠定实验基础。
1.1 仪器、试剂和动物
1260 infinity液相色谱系统、G1329B自动进样器、G1311C四元泵、G1314C紫外检测器、Kromasil C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)(美国安捷伦)；
HL-1S型恒流泵(上海青浦沪西仪器厂)；
BS 110S型电子分析天平(德国Sartorius)；
R-144型旋转蒸发仪(瑞士Buchi)；
Allegra X-22R台式高速冷冻离心机(美国Beckman-Coulter)。
Sco(纯度>98%，成都瑾哲生物科技有限公司)；
Soluplus(德国BASF)；
BCA蛋白定量检测试剂盒(武汉博士德生物科技有限公司)；
胃蛋白酶(上海明丰生物科技有限公司)；
戊巴比妥钠(上海纪宁实业有限公司)；
人工胃液及Krebs-Ringers溶液(参照药典配制)；
乙腈和甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯以上，水为纯水或超纯水。
SPF级雄性SD大鼠53只,体重(200±20)g，四川大学实验动物中心提供[动物许可证号:SYXK(川)2018-026]，自由摄食、饮水，于室温条件下饲养7 d后开始实验。
1.2 方法
1.2.1 Sco-Ms的制备 Sco-Ms 按参考文献[4]方法，将质量比为1∶15的Sco与Soluplus溶于二氯甲烷中，超声均匀分散，真空减压旋转蒸发除去有机溶剂，形成一层透明薄膜。再用一定量的分散介质溶解稀释，即得澄清透明的Sco-Ms溶液。
1.2.2 Sco在体胃肠样品的HPLC分析方法建立1)色谱条件：采用美国安捷伦1260 infinity液相色谱系统测定样品中Sco的含量。流动相：0.1%磷酸水溶液∶乙腈=7∶3；
流速：1 mL/min；
柱温：30 ℃；
检测波长：346 nm；
进样量：20 μL。2)标准样品处理方法：精密吸取一定浓度的Sco甲醇标准工作液，置于1.5 mL离心管中，加入100 μL水和200 μL甲醇，涡旋3 min，13 000 r/min,离心10 min(离心半径6 cm)，取上清液20 μL于上述色谱条件下进样，记录色谱峰面积。3)待测样品处理方法：精密吸取100 μL待测样品，加入300 μL甲醇，涡旋3 min，13 000 r/min,离心10 min(离心半径6 cm)，取上清液20 μL进样，记录色谱峰面积。4)专属性考察：取空白材料的甲醇溶液、空白胃液、空白Krebs-Ringer缓冲液、Sco的甲醇溶液和在体胃肠实验后的Sco样品，按1)项下HPLC条件进样，考察空白材料、空白胃液、Krebs-Ringer 缓冲液和胃肠样品的内源性成分是否干扰Sco的检测。5)标准曲线制备：精密吸取一定量的Sco甲醇溶液储备液，用甲醇逐级稀释配制成浓度分别为0.51、1.02、2.03、5.08、10.16、20.32、50.80、101.60、203.20 mg/L的Sco标准工作液。按照2)项下样品处理方法处理后，按HPLC测定方法进样测定，记录峰面积。以Sco的色谱峰面积(A)对药物浓度(C)进行线性回归，得到标准曲线的回归方程。6)回收率、精密度实验：精密吸取一定量的Sco甲醇标准储备液，用甲醇稀释并制备成低、中、高浓度分别为0.61、10.16、162.56 mg/L的Sco标准样品。取上述标准样品，按色谱条件分别进样5次并记录峰面积，根据5)项下回归方程计算Sco的浓度，计算回收率。另取上述标准样品溶液，分别于1 d内连续进样5次和连续5 d各进样1次，测定峰面积，计算日内、日间精密度。
1.2.3 Sco在大鼠胃肠黏膜匀浆液中的稳定性实验 参照文献[6-7]方法，取禁食过夜但自由饮水的大鼠3只，断颈处死。分别收集每只大鼠的胃及各肠段黏膜，采用冰冷生理盐水匀浆，于4 ℃,5 000 r/min,离心10 min(离心半径6 cm)，离心后取上清液重复离心1次，将上清液中蛋白浓度稀释至1 g/L备用。在稀释液中加入适量Sco溶液(最终浓度为10 mg/L，n=3)，于37 ℃水浴锅中孵育2 h，采用上述HPLC法测定孵育前后样品中Sco的含量。
1.2.4 在体原位胃灌注实验 参照文献[8-9]方法，取禁食过夜但自由饮水的大鼠10只，随机分为Sco组和Sco-Ms组，每组5只，腹腔注射45 mg/kg戊巴比妥钠麻醉。仰卧位固定，沿腹中线剪开腹腔，暴露胃部，分别在幽门及贲门切口并插管。用37 ℃生理盐水冲洗胃内容物，并用空气排空，结扎贲门。将2 mL含药人工胃液(200 mg/L)注入胃中，结扎幽门。将胃放回腹腔，切口处用浸有37 ℃生理盐水的纱布覆盖。2 h后抽取胃内溶液，并用人工胃液冲洗胃内2次，合并两液定容至10 mL，测定药物浓度(n=5)。
1.2.5 在体单向肠灌流实验 参照文献[8-9]方法，取禁食过夜但自由饮水大鼠40只，随机分为Sco组和Sco-Ms组，每组20只，每个肠段各5只，腹腔注射45 mg/kg戊巴比妥钠麻醉。仰卧位固定，沿腹中线剪开腹腔，选择相应肠段于上、下两端切口，用37 ℃生理盐水冲洗内容物，排空后下端切口结扎，腹部切口处用浸有37 ℃生理盐水的纱布覆盖。以0.3 mL/min速度,用37 ℃空白Krebs-Ringer缓冲液平衡20 min，排空后将37 ℃恒温供试液(200 mg/L Sco或Sco-Ms)全速泵入整截肠道，再将流速调至0.2 mL/min,平衡20 min后，于进口处用装有供试液的EP管进行灌流，出口处用EP管收集流出液。每次收集10 min，1 h内共收集6次。实验结束，后测量各肠段长度(l)和内径(r)，按下式计算Sco的表观渗透系数Papp和吸收速率常数Ka(n=5)：
Cin和Cout分别为供试液及流出液的浓度，Vin和Vout分别为灌入供试液及流出液的体积，Q为肠灌流速度。
1.3 统计学方法
2.1 Sco含量测定方法的建立
2.1.1 专属性 Sco的保留时间约为4.6 min，无杂质或内源性物质的干扰，专属性良好，说明该色谱条件下可对Sco进行专属性检测(图1)。
图1 HPLC色谱图
2.1.2 标准曲线 实验色谱条件下，峰面积(A)与Sco药物浓度(C)之间有良好的线性关系(r=0.999 9)，在0.51～203.20 mg/L浓度范围内，标准方程为A=13.823C-1.304。
2.1.3 回收率和精密度 按“1.2.2”项下所述方法进行回收率与精密度实验，Sco回收率为99.3%～101.3%(表1)，日内和日间精密度在0.6%～3.9%(表2)，以上结果说明该HPLC法符合日常含量测定要求。
表1 回收率实验结果
表2 精密度实验结果
2.2 Sco在大鼠胃肠黏膜匀浆液中的稳定性
按“1.2.3”项所示方法测定Sco在大鼠胃肠黏膜匀浆液中的稳定性。孵育2 h后，各组样品中Sco的减少比例均在5%以内，Sco在胃肠壁黏膜匀浆液中较为稳定(表3)。
表3 Sco在胃肠道黏膜匀浆液中的稳定性
2.3 在体原位胃灌注吸收结果
在胃中灌注2 h后，Sco和Sco-Ms的胃吸收百分率分别为(70.31±4.34)%和(75.93±4.10)%。与Sco组相比，Sco-Ms组在胃中的吸收率并没有明显提高(表4)。
表4 Sco和Sco-Ms的胃吸收百分率
2.4 在体单向肠灌流各肠段吸收参数
Sco在各肠段的Papp和Ka值差异无统计学意义(P>0.05)，均表现出良好的吸收；
与Sco原料药相比，Sco-Ms在十二指肠、空肠、回肠和结肠的Papp和Ka值均增加明显(P<0.05)，表明Sco-Ms可有效提高Sco在各肠段的渗透性(图2)。
图2 Sco和Sco-Ms在不同肠段的吸收参数
目前研究药物胃肠吸收机制的常用方法包括离体肠囊外翻法、在体肠灌流法和细胞模型法等，研究者们[10-12]证实了这些吸收模型和人体吸收具有良好的相关性。离体肠囊外翻法实验过程中需要翻转小肠，容易造成小肠形态学的破坏，致使结果出现较大偏差，且由于缺乏营养供应，组织易坏死[13]。Caco-2细胞模型对供试样品的要求较高，能较好地模拟体内肠道组织，与整体吸收具有良好的相关性，但不能代替整体动物实验[14]。在体肠灌流模型中,灌流器官基本完整，最接近于体内状态[15];流出液易收集，可避免因体内药物分配、消除所带来的影响，专注于吸收研究。在体小肠灌流又可分为小肠循环灌流法和小肠单向灌流法，对于吸收速率常数较小的药物，小肠循环灌流可能造成较大误差[16]。因此，本研究选择小肠单向灌流法来研究Sco和Sco-Ms的吸收部位和吸收动力学特性。小肠吸收药物的同时也会吸收一部分水分，从而引起肠灌流液体积的变化。本实验采用重量法校正流入与流出灌流液的体积，以消除因肠段吸收水分带来的影响[17]。
胃肠道中具有多种酶类，有的药物可能会在胃肠道内被代谢，使药物在消化道中减少速率增加，从而计算得到Papp值偏高[18]。前期研究[19]发现,Sco存在严重的首过效应[3]，进入Caco-2细胞后可被迅速代谢。本研究旨在考察药物在胃肠道黏膜匀浆液中的稳定性及Sco在体内参与的代谢过程，以便对Sco和Sco-Ms的渗透性和部位吸收特异性作出正确判断。本实验结果表明，Sco在胃肠道黏膜中稳定性良好，将代谢实验中蛋白浓度加大依然出现相似结果。同等实验条件下，桑色素则可在肠黏膜中发生不同程度的降解[20]。因此，认为Sco体内代谢相关的关键酶在胞内而非肠腔。
本研究在体原位胃灌注实验表明，Sco原料药在胃中的吸收良好，灌注2 h后，Sco在体内的吸收率可达70.31%,Sco-Ms的吸收率为75.93%，二者间差异无统计学意义(P>0.05)。这可能与Sco在胃中全部以分子形式存在，利于其跨膜吸收有关。
Sco在十二指肠、空肠、回肠和结肠的Papp分别为(8.48±1.03)×10-3cm/min、(8.44±1.17)×10-3cm/min、(8.05±1.15)×10-3cm/min和(7.17±1.18)×10-3cm/min，相互间差异无统计学意义(P>0.05)，所以在体肠灌流实验结果显示,Sco没有特异性吸收部位。研究[21]显示，当药物Papp>1.2×10-3cm/min时，表示其容易被吸收。Sco在各肠段的表观渗透系Papp均>1.2×10-3cm/min，表明Sco较易被肠道吸收。相较于Sco，Sco-Ms可进一步提高其在各肠段的Papp和Ka值。以上结果说明，口服后，Sco-Ms除了增加Sco在胃肠道中的溶解度外，还可进一步提高Sco在整个肠道中的渗透性，从而提高Sco的口服吸收率。
综上所述，Sco在胃肠道黏膜中较为稳定，Sco-Ms胶束系统能有效促进Sco在整个肠段的吸收，进而提高Sco的口服生物利用度。本研究将为Sco口服递药系统的设计提供参考依据，促进Sco的开发和利用。在将来的工作中，拟考察Sco-Ms在细胞水平上的摄取和转运，更加深入阐明其促吸收机制。
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