miRNA-132通过Wnt/β-catenin信号通路促进牙周膜干细胞成骨分化的研究

陈国勇 吴芳

[摘要]目的：探討miRNA-132通过Wnt/β-catenin信号通路促进牙周膜干细胞的成骨分化。方法：细胞培养，观察牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）形态。成骨诱导，检测成骨样分化情况。成脂诱导，检测成脂分化情况。将PDLSCs细胞分为3组，分别为对照组、miRNA-132模拟组和miRNA-132抑制剂组，采用八肽胆囊收缩素（Cholecystokinin octapeptide，CCK-8）检测PDLSCs细胞增殖，酶联免疫检测碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase protein，ALP）活性，茜素红染色检测矿化结节沉积，采用实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qRT-PCR）法检测成骨相关基因，采用Western blot检测Wnt/β-catenin相关通路蛋白。结果：miRNA-132模拟组的PDLSCs细胞增殖能力、ALP活性及矿化结节数量显著高于对照组，miRNA-132抑制剂组明显低于对照组和miRNA-132模拟组，差异有统计学意义（P<0.05）。miRNA-132模拟组中的ALP、Runx2、OCN和Osterix mRNA的相对表达明显高于对照组，miRNA-132抑制剂组显著低于对照组和miRNA-132模拟组，差异均有统计学意义（P<0.05）。miRNA-132模拟组中的GSK3β和β-catenin蛋白的表达明显高于对照组，miRNA-132抑制剂组明显低于对照组和miRNA-132模拟组，差异有统计学意义（P<0.05）。XAV-939组中的ALP、Runx2、OCN和Osterix mRNA的相对表达明显低于对照组，miRNA-132模拟组表达高于对照组和XAV-939组，miRNA-132模拟组+XAV-939组表达高于XAV-939组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：过表达miRNA-132可以促进牙周膜干细胞的成骨分化，抑制miRNA-132表达从而抑制了人牙周膜干细胞的成骨分化，miRNA-132调节牙周膜干细胞的成骨分化，其机制可能是通过Wnt/β-catenin信号通路来实现的。

[关键词]miRNA-132;Wnt/β-catenin;牙周膜干细胞;成骨分化;ALP;Runx2;OCN

[中图分类号]R780.2    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2022）06-0088-05

miRNA-132 Promotes Osteogenic Differentiation of Periodontal Ligament Stem Cells through Wnt/β-catenin Signaling Pathway

CHEN Guoyong，WU Fang

（Department of Stomatology，Zhuzhou Central Hospital，Zhuzhou 412007，Hunan，China）

Abstract：
Objective  To investigate the effect of miRNA-132 on osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells through Wnt / β - catenin signaling pathway. Methods  The morphology of PDLSCs was observed by cell culture. Osteogenic induction and osteogenic differentiation were detected. Adipogenic induction and adipogenic differentiation were detected. PDLSCs cells were divided into three groups：
the control group， the miRNA-132 simulation group and the miRNA-132 inhibitor group. The proliferation of PDLSCs cells was detected by CCK-8. ALP activity was detected by enzyme-linked immunosorbent assay. Mineralized nodule deposition was detected by alizarin red staining. Osteogenesis related genes were detected by qRT-PCR， and Wnt/β-catenin related pathway protein was detected by Western blot. Results  TThe proliferation ability， ALP activity and the number of mineralized nodules of PDLSCs in the miRNA-132 simulation group were significantly higher than those in the control group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The miRNA-132 inhibitor group was significantly lower than the control group and miRNA-132 simulation group （P<0.05）. The relative expression of ALP， Runx2， OCN and Osterix mRNA in the miRNA-132-132 simulation group was significantly higher than those in the control group， and the miRNA-132 inhibitor group was significantly lower than the control group and miRNA-132 simulation group （P<0.05）. The expression of GSK3β and β-catenin protein in the miRNA-132 simulation group was significantly higher those that in control group， and the miRNA-132 inhibitor group was significantly lower than the control group and miRNA-132 simulation group （P<0.05）. The relative expression of ALP， Runx2， OCN and Osterix mRNA in the XAV-939 group was significantly lower than those in the control group （P<0.05）. The expression in the miRNA-132 simulation group was higher than those in the control group and the XAV-939 group （P<0.05）. The expression in the miRNA-132 simulation + XAV-939 group was higher than those in the XAV-939 group （P<0.05）. Conclusion  Overexpression of miRNA-132 can promote the osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells， and inhibit the expression of miRNA-132， thus inhibiting the osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells. The mechanism of miRNA-132 regulating the osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells may be through Wnt/β-catenin signaling pathway.

Key words：
miRNA-132; Wnt/β-Catenin; PDLSCs; osteogenic differentiation; ALP; Runx2; OCN

牙周炎是一种与微生物相关、并由宿主介导，最终导致牙周附着丧失的慢性炎症性疾病，主要表现为牙周韧带组织、牙骨质、牙槽骨损伤和牙齿松动脱落，是引起牙齿缺失的主要原因[1]。目前，高达40%以上的人群存在牙周炎疾病，高发人群主要集中在35岁以上，年龄越大发生牙周炎的几率越高[2]。牙周组织完全不同于其他组织，一旦牙周骨组织丧失，凭借自身的修复能力或者简单的牙周治疗无法实现再生，主要原因是由于在牙周炎的微环境中牙周膜干细胞（Periodontal ligament stem cells，PDLSCs）的分化能力受损导致[3]。PDLSCs具有多向分化潜能，可以维持自身干性和自我更新能力，被认为是组织工程中具有再生组织的种子细胞[4]。Wnt信号通路是存在于多细胞真核生物中的信号转导途径，分为经典Wnt/β-catenin信号通路和非经典Wnt/Ca2+、Wnt/PCP等信号通路[5]。其中Wnt/β-catenin信号通路是目前研究最多的一条通路，在胚胎分化、中枢神经系统形成、干细胞的定向分化中发挥着重要的作用[6]。miRNA在生物学调节方面起着重要的作用，miRNA-132被认为是调节血管生长的开关，在肿瘤的发生和发展中起着至关重要的作用[7]。但关于在牙周膜干细胞的成骨分化中的相关报道较少，因此，本研究旨在探讨miRNA-132是否可通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进PDLSCs的成骨分化，以期为临床治疗牙周炎提供一定的理论依据。

1  材料和方法

1.1 主要试剂：胎牛血清购自美国Gibco公司，miRNA-132 mimics、miRNA-132 inhibitor购自上海吉玛制药技术有限公司，Wnt通路抑制剂XAV-939购自南京建成科技有限公，磷酸盐缓冲液购自广州赛国生物科技有限公司，胰蛋白酶购自碧云天生物技术有限公司，茜素红染色液、油红O染色液购自天津市津东天正精细化学试剂厂，CCK-8细胞活性检测试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 取材：收集临床上年龄18～35岁的非牙周炎患者25例，均为无炎症的阻生智齿或正畸牙，经患者同意，知情确认，并且通过医院伦理委员会批准。收集后放入含有少量20%胎牛血清完全培养基的无菌培养皿中，准备实验操作使用。

1.2.2 细胞培养：将牙齿转移至无菌培养皿，用5%双抗的PBS冲洗牙齿，并滴加培养液，采用无菌手术刀片刮取根中1/3牙周膜组织，放置培养瓶底部，分化离纯原代PDLSCs，在5% CO2的37℃培养箱中培养，原代PDLSCs放置于1%抗生素和20%胎牛血清的培养基中培养，当细胞融合度达到80%时进行传代培养，PBS冲洗，0.25%胰蛋白酶消化，使用移液枪吹打后将细胞悬液转移到离心管中，离心处理，弃上清，新鲜培养基重悬，放在新的培养瓶中继续培养，培养基每3 d更新一次，第3～5代的PDLSCs用于后续实验。

1.2.3 成骨诱导：将生长状态良好的PDLSCs接种于6孔板中，观察细胞的融合情况，当达到60%时，更换成骨培养液，每3 d更换一次，21 d后，弃掉原培养液，PBS冲洗，4%多聚甲醛固定20 min，PBS再次冲洗，每孔加入2 ml的2%茜素红染色液，40 min后，双蒸水冲洗，显微镜下观察并拍照。

1.2.4 成脂诱导：将生长状态良好的PDLSCs接种于6孔板中，观察细胞的融合情况，当达到60%时更换成骨培养液，每3 d更换一次，21 d后，弃掉原培养液，PBS冲洗，4%多聚甲醛固定20 min，PBS再次冲洗，每个孔加入2 ml的油红O染色液，40 min后双蒸水冲洗，显微镜下观察并拍照。

1.2.5 PDLSCs細胞增殖检测：采用CCK-8检测，将PDLSCs细胞分为3组，分别为对照组、miRNA-132模拟组和miRNA-132抑制剂组，对照组加入等量的PBS，miRNA-132模拟组和miRNA-132抑制剂组分别转染miRNA-132 mimics、miRNA-132 inhibitor，孵育21 d。再将3组的PDLSCs消化、离心，重悬计数，加入适量完全培养基调整细胞浓度为2×104个/毫升，24 h后更换培养基，观察1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d六个时间的细胞增殖情况，弃掉原培养基，加CCK-8溶液，孵育45 min，酶标仪450 mm下检测OD值。

1.2.6 ALP活性检测：将3组PDLSCs弃去培养液，PBS洗涤，将3组分别加入2 ml 0.2% TritonX-100，过夜，取上清，按照碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒的说明书，进行严格操作，3组各取5 μl置于96孔板中，加入双蒸水30 μl，基质液50 μl，缓冲液50 μl，0.02 mg/ml酚标准应用液，加入150 μl显色剂，充分混匀，酶联免疫检测仪检测520 nm下测定吸光度。

1.2.7 茜素红染色检测矿化结节沉积：将生长状态良好的PDLSCs接种于6孔板中，21 d后，4%多聚甲醛固定后，茜素红染色，显微镜下观察并拍照，然后10%氯化十六烷基吡啶加入染色板中溶解矿物结节，用酶标仪在562 nm处测定溶液的吸光度，以定量矿化基质沉积的含量。

1.2.8 成骨相关基因检测：采用qRT-PCR法检测成骨相关基因ALP、Runx2、OCN和Osterix mRNA的相对表达量，对3组细胞进行RNA提取，再进行RNA纯化，采用超微量分光光度计测定RNA的浓度和纯度，逆转录反应合成cDNA，使用Real Time PCR扩增仪，进行PCR扩增反应，然后进行成骨诱导培养7 d，检测不同组Runx2、OSX、ALP的表达水平。以GAPDH作为内参基因。为了验证miRNA-132可通过Wnt/β-catenin信号通路调控PDLSCs的成骨分化，取PDLSCs细胞将其分成4组，分别为对照组、XAV-939组、miRNA-132模拟组和miRNA-132模拟组+XAV-939组。对照组加入等量的PBS，XAV-939组转染XAV-939抑制剂，miRNA-132模拟组转染miRNA-132 mimics，miRNA-132模拟组+XAV-939组同时转染miRNA-132 mimics和XAV-939抑制剂，孵育21 d，具体成骨相关基因检测按照以上方法进行操作，具体引物序列见表1。

1.2.9 Wnt/β-catenin相关通路蛋白检测：采用Western blot检测，将三组转染并成骨诱导后的PDLSCs加入RIPA裂解，用BCA蛋白检测试剂盒对收集的总蛋白浓度进行定量，所有蛋白样品通过10% SDS-PAGE胶分离，转移到PVDF膜，依次加入相应的GSK3β（1：500稀释）和β-catenin（1：500稀释）一抗，加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（1：1 000稀释）室温避光孵育，TBST清洗，增强化学发光底物试剂盒和化学成像系统检测免疫反应蛋白。用Image J软件对蛋白表达进行定量，GAPDH作为内参。

1.3 统计学分析：采用SPSS 21.0软件进行统计学处理，符合正态分布的定量数据使用均数±标准差（x¯±s）描述，两组资料间比较采用t检验进行，多组资料间比较采用SNK-q检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2  结果

2.1 PDLSCs形态学观察：原代细胞培养7～14 d显微镜观察，组织块周围有牙周膜细胞爬出，见图1A;分离纯化后的PDLSCs，24 d后细胞长满至孔底2/3，细胞体积小，胞体丰满，部分呈长梭形，部分呈圆形和椭圆形，核浆多，胞浆少，传代后细胞呈旋涡状和放射状排列，见图1B。

2.2 PDLSCs的鉴定：茜素红染色显示，体外矿化诱导的条件下，PDLSCs形成矿化结节，可向成骨样分化的潜能，见图2A;油红O染色结果显示，体外成脂诱导条件下，形成油红O染色的脂滴，可向成脂分化的潜能，见图2B。

2.3 miRNA-132对PDLSCs细胞增殖的影响：CCK-8检测结果表明，miRNA-132模拟组的PDLSCs细胞增殖能力明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;miRNA-132抑制剂组的PDLSCs细胞增殖能力显著低于对照组和miRNA-132模拟组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图3。

2.4 miRNA-132对ALP活性和矿化结节沉积的影响：ALP活性检测结果显示，miRNA-132模拟组中的ALP活性明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;miRNA-132抑制剂组中的ALP活性显著低于对照组和miRNA-132模拟组，差异有统计学意义（P<0.05），见图4。茜素红染色检测结果显示，miRNA-132模拟组中矿化结节的数量显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;miRNA-132抑制剂组中矿化结节的数量明显低于对照组和miRNA-132模拟组，差异有统计学意义（P<0.05），见图5。

2.5 miRNA-132对PDLSCs成骨相关基因表达的影响：miRNA-132模拟组中的ALP、Runx2、OCN和Osterix mRNA的相对表达明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;miRNA-132抑制剂组中的ALP、Runx2、OCN和Osterix mRNA的相对表达显著低于对照组和miRNA-132模拟组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图6。

2.6 miRNA-132对Wnt/β-catenin相关通路蛋白表达的影响：miRNA-132模拟组中的GSK3β和β-catenin蛋白的表达明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;miRNA-132抑制剂组中的GSK3β和β-catenin蛋白的表达显著低于对照组和miRNA-132模拟组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图7。

2.7 miRNA-132可通过Wnt/β-catenin信号通路调控PDLSCs的成骨分化：XAV-939组中的ALP、Runx2、OCN和Osterix mRNA的相对表达明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;miRNA-132模拟组中的ALP、Runx2、OCN和Osterix mRNA的相對表达明显高于对照组和XAV-939组，差异有统计学意义（P<0.05）;miRNA-132模拟组+XAV-939组中的ALP、Runx2、OCN和Osterix mRNA的相对表达高于XAV-939组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图8。

3  讨论

牙周膜是位于牙骨质和牙槽骨之间的致密非矿化结缔组织，在牙周组织的维持和再生中起着非常重要的作用[8]。而PDLSCs是一种多向分化潜能的干细胞，可以向成骨细胞、脂肪细胞和成牙细胞方向分化，并且可以矿化骨组织[9]。为实现口腔骨组织维持、修复、骨再生以及正畸牙周改建提供重要的临床应用价值，PDLSCs成骨向分化是多种调控介质和行为模式的生物学过程，为牙周组织或其他组织结构再生提供了一定的理论依据。相关研究表明，miR-125b通过靶向下调Cx43而抑制PDLSCs的成骨分化[10]，miR-124可靶向调控OSX对PDLSCs成骨分化能力产生抑制作用，提示miR-124在PDLSCs组织修复再生过程中发挥重要作用[11]。但miRNA-132通过Wnt/β-catenin信号通路促进牙周膜干细胞的成骨分化确未出现相关报道，因此对其进行探讨，分析miRNA-132与Wnt/β-catenin信号通路的关系以及对牙周膜干细胞的成骨分化作用。

miRNA的作用多种多样，并具有高度的保守型，通过调控基因的表达，参与细胞的分化和组织发育[12]。近年来，miRNA与在干细胞成骨分化方面取得了较大的进展，相关研究表明，糖尿病微环境下BMSCs，miRNA-31处于高表达，并可以抑制BMSCs的成骨分化[13]。也有研究报道，miRNA-30a作为调控MSC软骨分化的潜在靶点，对于软骨再生和软骨发育相关疾病的应用和防治具有重要意义[14]。所以说明miRNA作为一种重要的调节因子参与干细胞骨向分化。本研究主要对miRNA-132促进牙周膜干细胞的成骨分化进行探讨，研究结果发现，过表达miRNA-132可以促进PDLSCs细胞的增殖能力，抑制miRNA-132的表达PDLSCs细胞增殖能力出现明显的降低。同时对ALP活性和矿化结节沉积情况进行对比分析发现，过表达miRNA-132可以促进ALP活性和矿化结节的数量，抑制miRNA-132的表达，明显降低了ALP活性和矿化结节的数量。ALP属于一种非常重要的水解酶，在成骨细胞分化过程中起着至关重要的作用，反应成骨细胞启动钙化程序与否，可以作为成骨分化的早期标志物[15]。矿化结节的形成表明细胞向成骨细胞分化，且具有新骨形成的潜力[16]。

本研究通过PDLSCs成骨相关基因表达进行验证，发现过表达miRNA-132可以使ALP、Runx2、OCN和Osterix mRNA的相对表达明显升高，抑制miRNA-132的表达，可以降低ALP、Runx2、OCN和Osterix mRNA的相对表达。又通过miRNA-132对Wnt/β-catenin相关通路蛋白表达进行验证，过表达miRNA-132可以使的GSK3β和β-catenin蛋白的表达明显升高，抑制miRNA-132的表达，可以降低GSK3β和β-catenin蛋白的表达。进一步证明miRNA-132通过Wnt/β-catenin信号通路促进牙周膜干细胞的成骨分化的影响，发现抑制Wnt/β-catenin信号通路，ALP、Runx2、OCN和Osterix mRNA的相对表达明显降低;同时对miRNA-132和Wnt/β-catenin信号通路进行抑制，发现ALP、Runx2、OCN和Osterix mRNA的相对表达高于单纯抑制Wnt/β-catenin信号通路表达的一组。相关研究表明，MicroRNA-22通过靶向HDAC6提高ALP、Runx2、OCN和Osterix的表达，促进人牙周膜干细胞的成骨分化[17]。也有研究表明，MicroRNA-374a通过直接靶向APC/Wnt/β-catenin信号通路促进牙周膜干细胞的成骨分化[18]。另有研究报道，MicroRNA-21通过靶向Smad5调控牙周膜干细胞的成骨分化[19]。因此说明miRNA通过靶向不同的信号通路具有调控PDLSCs成骨分化的作用。

总之，过表达miRNA-132可以促进牙周膜干细胞的成骨分化，抑制miRNA-132表达从而抑制了人牙周膜干细胞的成骨分化，miRNA-132调节牙周膜干细胞的成骨分化，其机制可能是通过Wnt/β-catenin信号通路来实现的。

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[收稿日期]2021-04-19

本文引用格式：陈国勇，吴芳.miRNA-132通过Wnt/β-catenin信号通路促进牙周膜干细胞成骨分化的研究[J].中国美容医学，2022，31（6）：88-92，109.

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