【高效液相色谱-静电场轨道阱质谱鉴定大鼠血浆中蟾蜍二烯内酯及其代谢物】超高效液相色谱质谱

　　摘 要 [HTSS]建立了高效液相色谱�质谱鉴定大鼠口服蟾酥总内酯提取物后血浆中蟾蜍二烯内酯类化合物及其主要代谢物的分析方法。大鼠单剂量灌胃（50 mg/kg）蟾酥总内酯提取物后收集血浆样品，乙腈沉淀蛋白，浓缩定容，采用HPLC�MS分析。利用色谱保留时间、高分辨质谱提供的精确分子量和碎片离子精确质量的信息，鉴定了24种蟾蜍二烯内酯类化合物和20种可能的代谢物。其中5个化合物与相应的标准品一致。本方法快速、灵敏，适用于鉴定血浆中的微量蟾蜍二烯内酯类化合物及其体内代谢物。
　　关键词 [HTSS]蟾酥; 蟾蜍二烯内酯; 代谢物; 血浆; 高效液相色谱； 静电场轨道阱质谱法�
　　
　　1 引 言�
　　蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍（�Bufo gargarizans� Cantor）或黑眶蟾蜍（�Bufo melanostictus �Schneider）等的耳后腺及皮肤腺分泌的白色浆液, 经加工干燥而成��[1]�。其性味辛温, 有毒, 具有解毒、消肿、醒神、开窍、强心和止痛等作用��[2]�，在临床上被广泛应用于治疗多种癌症、结核病、心脏病、恶性血液病、周期性面神经麻痹、急性咽炎和慢性乙肝等感染病, 还可以用于局部麻醉等��[3～6]�。临床上应用的蟾酥注射液、活心丸、救心丸、蟾龙定喘合剂、喉症丸等50余种中成药中均含有蟾酥��[6,7]�。蟾酥的主要化学成分有蟾蜍内酯类、吲哚碱类、甾醇类及多肽类等��[1]�。其中已分离鉴定的蟾蜍二烯内酯类化合物逾40种��[8～12]�，被认为是蟾酥的主要药效成分。�
　　以往对蟾酥及其配方制剂的成分研究多侧重于药物本身蟾蜍内酯类化合物的分析��[4,6,8～10]�，对该类成分在体内的吸收代谢的研究报道很少��[3,13～15]�。而蟾蜍内酯类成分在体内的吸收和代谢研究对阐明蟾酥的药理作用以及临床用药安全具有重要的指导意义。然而，蟾酥的成分复杂，给药后经动物肠道菌群及体内代谢后成分更为复杂，而且含量低，蟾酥在动物体内的成分分析对仪器及分析技术提出了更高的要求。�
　　近年来，液相色谱�质谱联用技术被广泛应用于中药及其代谢物分析，其优点在于能够实现复杂成分的在线检测和鉴定。质量高分辨和多级串联功能的质谱仪与液相色谱联用，为成分鉴定的准确性提供了更有力的保障。本研究利用高效液相色谱�线性离子阱�静电场轨道阱组合式高分辨质谱联用仪（HPLC�LTQ�Orbitrap�MS）分析鉴定了蟾蜍内酯类化合物口服给药后在大鼠血浆中的成分及其代谢物，发现血浆中含有原药中24种蟾蜍二烯内酯类成分和20种代谢物，初步探讨了蟾蜍内酯类成分在大鼠血液中的吸收和代谢情况，本研究结果为蟾酥活性成分的体内药理毒理作用研究提供了理论依据。2 实验部分�
　　2.1 仪器�
　　SURVEYORHPLC液相色谱仪（美国Thermo Scientific公司）；LTQ Orbitrap XL组合式高分辨质谱仪（美国Thermo Scientific公司）；Poroshell SB�C��18�快速分离型高效液相色谱柱（100 mm×2.1 mm, 2.7
　　�SymbolmA@ m, 美国Agilent公司）；TG18M高速离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）；MS2型涡旋振荡器（广州IKA公司）。�
　　2.2 材料、试剂与动物�
　　日蟾毒它灵（Gamabufotalin）、沙蟾毒精（Arenobufagin）、蟾毒灵（Bufalin）、脂蟾毒配基（Resibufogenin）和华蟾毒配基（Cinobufagin）对照品（暨南大学中药及天然药物研究所分离并鉴定，HPLC分析纯度大于98%）；蟾酥饼（山东临沂医药有限公司）；甲醇和乙腈（色谱纯, 美国Burdick & Jackson公司）；甲酸（分析纯, 广州化学试剂厂）；实验用水为超纯水设备（美国Mili�Q公司）制备的超纯水。实验动物为雄性SD大鼠（体重200～220 g，广东省医学实验动物中心）。�
　　2.3 实验步骤�
　　2.3.1 蟾酥总内酯的制备 将100 g蟾酥饼粉粹，以1 L 95%乙醇分两次超声浸提，过滤，合并滤液，减压旋转蒸发回收乙醇，剩余物中加入200 mL二氯甲烷超声提取，过滤，滤液减压旋转蒸发回收二氯甲烷，冷冻干燥，得到蟾酥内酯类化合物（总内酯）12 g。用丙二醇溶解并定容， 得30 g/L蟾酥总内酯溶液。�
　　2.3.2 给药方法
　　雄性SD大鼠8只，禁食12 h后，其中6只50 mg/kg剂量蟾酥总内酯灌胃给药，另�2只灌胃等体积的丙二醇�，给药或丙二醇后分别在10, 20, 35, 60和120 min颈静脉采血，每次取血约�2 mL�，转入预先用0.3%肝素钠溶液湿润过的EP管，置于冰水中。�
　　2.3.3 样品处理 血样静置约5 min后，以3000 r/min离心8 min，吸取上清血浆，加入约�2倍量的乙腈�，漩涡5 min，超声10 min，12000 r/min离心10 min，吸取上层清液，合并同一大鼠不同时间点血浆经处理后上清液，氮气吹干，残留物加200
　　�SymbolmA@ L甲醇溶解，过0.45
　　�SymbolmA@ m滤膜，待分析。�
　　
　　2.3.4 样品分析
　　样品采用SURVEYOR HPLC与LTQ Orbitrap XL联用分析。Agilent Poroshell �SB�C��18�快速分离型高效液相色谱柱（�100 mm×2.1 mm, 2.7
　　�SymbolmA@ m）；流动相A为水（含0.5%甲酸），B为乙腈；�0 min�，80% A＋10% B；0～7 min，流动相B从0%升至30%；7～35 min, 流动相B从30%升至45%；35～40 min， 流动相B从45%升至95%； 40～45 min， 5%A+95% B；45～46 min, 流动相B从95%降至20%; 46～55 min, 80%A＋20%B。流速0.3 mL/min；进样量1
　　�SymbolmA@ L。离子化方式：电喷雾（ESI）正离子模式；喷雾电压：4.5 kV；管状透镜电压：80 V；鞘气压力：214 kPa；辅助气压力： 55 kPa； 扫描质量范围：�m/z 100～700�；扫描模式：一级质谱质量分辨率R＝30000； 二级质谱质量分辨率R＝7500。
　　3 结果与讨论�
　　3.1 蟾酥总内酯的化学成分鉴定�
　　图1A为蟾酥总内酯样品分析的总离子流质量色谱图，通过分析每个色谱峰保留时间、准分子离子和碎片离子的精确质荷比（m/z），并与文献[9,10]比较，推测出蟾酥总内酯样品中共含有24个蟾蜍二烯内酯类化合物。每个化合物通过一级高分辨质谱的精确分子量信息推测出其可能分子式，二级高分辨质谱碎片精确m/z信息推测出离子碎片化学式，并结合其在C��18�色谱柱的保留时间，与文献[9,10]比较，对24个蟾蜍二烯内酯类化合物进行了鉴定，化合物结构见图2，详细信息见表1（详表见http://www.省略/table/110334.pdf）。其中日蟾毒它灵（2）、沙蟾毒精（4）、蟾毒灵（22）、华蟾毒配基（23）和脂蟾毒配基（24） 5个化合物通过与对照品的色谱保留时间、一级准分子离子和二级碎片离子质谱信息进行比较而得到了确证。图3给出了沙蟾毒精的质谱裂解可能途径。
　　3.2 大鼠血浆中蟾酥内酯类化合物及其代谢物鉴定�
　　蟾蜍内酯通过肠道吸收和微生物转化进入血液，其原形化合物和代谢物可能同时在血浆中存在。文献[3,15]指出，蟾蜍内酯类化合物在体内可能发生的生物转化主要有4类：（1） 3位羟基羰基化；�（2） 3位羟基羰基化后再反向羟基化�，形成差向异构体；（3） 含有乙酰基的蟾蜍内酯化合物去乙酰化，去乙酰化代谢物同时可发生（1）和（2）类转化形成新的代谢物；（4） 某些蟾蜍内酯或其（1）和（2）类代谢物12位碳原子羟基化。由于蟾蜍内酯和代谢物在血浆中的含量较低，并且血浆样品基体复杂，很多含量低的化合物在总离子流质量色谱图中很难被发现。因此，采用提取离子流的方法对血浆中的原形化合物和代谢物进行分析鉴定，由于LTQ�Orbitrap�MS提供了原形药物和代谢物的一级和二级离子的精确m/z，通过提取一级质谱中的精确m/z离子可很容易找到原形化合物和可能的代谢物。采用提取高分辨质谱精确质量离子在复杂基体样品中寻找目标物的准确性远高于普通MS。根据以上4种可能的蟾蜍内酯体内生物转化途径，计算出24种蟾蜍二烯内酯类化合物可能的代谢物精确准分子量，与原形化合物的精确准分子量一起进行提取离子流分析，原药中24种蟾蜍二烯内酯类成分在大鼠血液中均能检测到，同时多检测出20个化合物（M1～M20）。而空白血浆样品中未检测到该20种化合物对应的准分子离子，证明这些化合物均为蟾酥总内酯给药后在大鼠体内的代谢物。从图3的质谱裂解途经可以看出，沙蟾毒精与其3�epi�差向异构体的裂解途经与原形化合物应该是一致的，因此，通过比较二级高分辨质谱提供的精确m/z，可推断出代谢物与原形化合物的关系。Ma等��[15]�研究了蟾蜍内酯、其3位羰基代谢物和其�3�epi�羟基差向异构体代谢物在C��18�柱上的保留时间�，发现原形化合物最先洗脱，然后为�3�epi�差向异构体�，3位羰基代谢物最后洗脱，这一规律也可用于判断蟾蜍内酯代谢物与原形化合物之间的关系。通过以上规律对血浆样品中新出现的20个化合物进行结构推测，详细信息见表1。图1B�
　　�
　　��
　　Fig．2 Chemical structures of bufadienolides from ChanSu extract identified by HPLC�MS[TS）]
　　[TS（][HT5”SS]图3 沙蟾毒精准分子离子的质谱裂解可能途径�
　　Fig．3 Proposed MS�n fragmentation mechanism of protonated arenobufagin[TS）]
　　
　　给出了大鼠给药后血浆样品分析的m/z 417.2272, 403.2481, 401.2325,
　　415.2119, 399.2170, 457.2223, 459.2381, 473.2175, �445.2588�, 443.2432, 387.2535, 385.2375和[TS（][HT5”SS] 图4 蟾蜍它灵在大鼠体内可能发生的生物转化过程�
　　Fig．4 A proposed biotransformation pathway of bufotalin in rat[TS）]383.2220提取离子流质量色谱图。图4给出了蟾蜍它灵在大鼠体内可能发生的生物转化过程。
　　
　　�
　　根据表1鉴定结果，初步推断M2和M3为日蟾毒它灵（2）的代谢产物，M1和M4为异沙蟾毒精（3）的代谢产物，M5, M6, M9, M13和M15为蟾蜍它灵（17）的代谢产物，M8和M10为沙蟾毒精（4）的代谢产物，M11和M12为远华蟾毒精（15）的代谢产物，M14和M16为海蟾蜍精（21）的代谢产物，M17和M18为蟾毒灵（22）的代谢产物，M7, M19和M20为脂蟾毒配基（24）的代谢产物。
　　
　　
　　References��
　　1 Zhang Ying, Qiu Ying�Kun, Liu Ke, Jiang Yong�Tao, Chen Ji�Yong, Dou De�Qiang（张 英, 邱鹰昆, 刘 珂, 姜永涛, 陈继永, 窦德强）. �Chinese Tradit. Herb. Drugs�（中草药）, 2006, 37（12）: 1905～1908��
　　2 Zhao Qiang, Meng Fan�Jing, Liu An�Xi（赵 强, 孟凡静, 刘安西）. �Chinese Tradit. Herb. Drugs�（中草药）, 2004, 35（10）: 附4～7��
　　3 Xia X L, Jin H Z, Yan S K, Zhang W D. �J. Pharm. Biomed. Anal.,� 2010, 53（3）: 646～654��
　　4 Ye M, Guo H, Guo H Z, Han J, Guo D. �J. Chromatogr. B,� 2006, 838（2）: 86～95��
　　5 YIN Yue�Fen, ZHANG Xiao�Li, CHEN Jun�Hui, Lee Frank Senchun, WANG Xiao�Ru（殷月芬, 张晓理, 陈军辉, 黎先春, 王小如）. �Chinese Pharm. J.�（中国药效杂志）, 2009, 44（8）: 623～627��
　　6 ZHU Ling�Ying, QIAN Da�Wei, DUAN Jin�Ao, QIAN Shi�Hui, LI Xin�Jie（朱玲英, 钱大纬, 段金傲, 钱士辉, 李欣洁）. �Chinese Tradit. Pat. Med.� （中成药）, 2008, 30（5）: 625～628��
　　7 Hong Z, Chan K, Yeung H W. �J. Pharm. Pharmacol.,� 1992, 44（12）: 1023～1026��
　　8 Krenn L, Kopp B. �Phytochem., � 1998, 48（1）: 1～29��
　　9 CAO Yang, LIANG Qiong�Lin, ZHANG Hong�Yang , WANG Yi�Ming, BI Kai�Shun, LOU Guo�An（曹 阳, 梁琼麟, 章弘扬, 王义明, 毕开顺, 罗国安）. �Chinese J . Anal. Chem.� （分析化学）, 2008, 36（1）: 39～46 �
　　10 Ye M, Guo D A. �Rapid Commun. Mass Spectrom.,� 2005, 19（13）: 1881～1892�
　　11 Kamano Y, Nogawa T, Yamashita A, Hayashi M, Inoue M, Draar P, Pettit G R. �J. Nat. Prod.�, 2002, 65（7）: 1001～1005�
　　12 Tian H Y, Wang L, Zhang X Q, Wang Y, Zhang D M, Jiang R W, Liu Z, Liu J S, Li Y L, Ye W C. �Chem. Eur. J.,� 2010, 16（36）: 10989～10993�
　　13 Liang Y, Liu A H, Qin S, Sun J H, Yang M, Li P, Guo D A. �J. Pharm. Biomed. Anal.�, 2008, 46（3）: �442～448��
　　14 LIANG Xiao�Ping, ZHANG Zheng, HU Ping, ZHONG Hong�Fu, GE Zhao�Hui, ZOU Ting�Ting, LIANG Qiong�Lin, WANG Ming�Yi, LUO Guo�An（梁晓萍， 张 政， 胡 坪， 钟宏福， 葛朝晖， 邹婷婷， 梁琼麟，王明义， 罗国安）. China J. Chinese Universities（高等学校化学学报）, 2011, 32（1）： 38～43�
　　15 Ma X C, Cui J, Zheng J, Guo D A. �J. Mol. Catal. B: Enzymatic�, 2007, 48（1�2）: 42～50�
　　�
　　
　　Identification of Bufadienolides and Its Metabolites in Rat�
　　Plasma by High Performance Liquid Chromatography Coupled�
　　with Linear Trap Quadrupole�Orbitrap Mass Spectrometry
　　�
　　�
　　CHEN Jian�Xin�1, DENG Jie�Wei�2, CHEN Hong�1, TIAN Hai�Yan�3, YANG Yun�Yun�2, YE Wen�Cai��*3��
　　��1（College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510640） �
　　�2（China National Analytical Center Guangzhou, Guangzhou 510070） �
　　�3（Institute of Traditional Chinese Medicine and Natural Products, Jinan University, Guangzhou 510632）
　　��
　　�
　　Abstract A method based on high performance liquid chromatography coupled with Linear trap �quadrupole（LTQ）�Orbitrap� mass spectrometry （HPLC�LTQ�Orbitrap�MS） was developed for the �identification� of the bufadienolides and its metabolites in rat plasma. The rat plasmas were collected after �oral� administration of lactones from ChanSu extract （50 mg/kg）. The plasma samples were �precipitated� by acetonitrile and concentrated, and then analyzed by HPLC�LTQ�Orbitrap�MS. 24 �bufadienolides� and the 20 metabolites were identified according to their elution orders in C18 column, exact �molecular� weight and MS/MS fragmentation provided by high�resolution MS/MS. 5 standards of �bufadienolides� were used for corroboration. The method is fast, sensitive and suitable to identify trace bufadienolides and its metabolites in plasma. �
　　Keywords Chansu; Bufadienolides; Metabolite; Plasma; High performance liquid chromatography； Linear trap quadrupole�orbitrap�mass spectrometry�
　　
　　（Received 7 April 2011; accepted 25 July 2011）�

推荐访问:代谢物 内酯 蟾蜍 高效液相色谱-静电场轨道阱质谱鉴定大鼠血浆中蟾蜍二烯内酯及其代谢物 高效液相色谱仪 气相色谱