梅毒螺旋体抗体快速试剂的实验室性能评价
时间：2023-06-30 18:55:02 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
夏德菊，袁柳凤，周潜，许四宏，尹跃平
梅毒是由梅毒螺旋体（treponema pallidum，TP）感染引起的慢性、系统性性传播疾病[1]。据世界卫生组织统计，全球每年有近两千万的梅毒新发感染者，随着我国经济的发展和人口迁移的加快，从2005 - 2014年，梅毒病例增加了近三倍[2]。梅毒可由受感染的孕妇传给胎儿，威胁下一代健康；
系统性的梅毒也增加了其他病原体感染的机会，如人类免疫缺陷病毒[3-4]。及时诊断和治疗对于减少梅毒发病率以及梅毒螺旋体向性伴侣和新生儿的传播至关重要，通过早期发现母体感染并及时治疗几乎可以完全预防先天性梅毒[5]。在资源有限且难以进入实验室或梅毒筛查的地区，快速床旁（POC）检测可以增加检测人数，并为临床服务提供同期治疗的机会。此方法衍生的快检试剂可以在室温下储存，操作时不需要任何设备，并且可以使用通过手指穿刺获得的全血直接检测，目前在发展中国家以及快速检测应用场景中有独特优势[6-8]。
目前，我国已有超三十个企业研制出了 TP 抗体快速检测试剂，此类试剂是以胶体金或硒为标记物、以硝酸纤维素膜为载体、以层析形式进行固相免疫测定的技术为原理而制备的。如此多的 TP 快检试剂一方面为梅毒的即时检测提供便利，但另一方面由于各生产单位所用抗原不同、工艺不同等，其产品的质量也可能不同，而且前期一项研究表明，梅毒螺旋体抗体检测试剂对不同临床时期梅毒感染样本的检测灵敏度有显著性差异[0]，因此为客观评价 TP 抗体快速试剂质量水平以及比较各试剂之间的质量差异，本研究选用前期本科室研制的梅毒螺旋抗体快速试剂国家参考品以及商品化的血清转化盘和不同临床时期的梅毒样本对目前市面主要使用的 TP 抗体快速检测试剂进行性能评价。
1.1 材料
1.1.1 评价样本 梅毒螺旋体抗体快速试剂国家参考品由中国食品药品检定研究院传染病诊断试剂二室制备并提供，批号为 370035-201801。该套参考品由 10 份阳性样本，20 份阴性样本，3 份最低检出限样本及 1 份精密度样本组成。梅毒血清转换盘购自 SeraCare 公司，是于 2012年从美国一位 41 岁女性采集的 9 支样本（分别在第0、5、10、13、31、45、48、52 和 59 天采集），该转换盘所有样本未经稀释，未加防腐剂，为梅毒自然进程中的原始样本。不同临床时期的梅毒样本由首都医科大学附属北京地坛医院提供，一期梅毒样本 8 份，二期梅毒样本 10 份，三期梅毒样本5 份，潜伏期梅毒样本 12 份，梅毒治愈后样本16 份，共计 51 份样本，均为检验科剩余样本。1.1.2 评价试剂 待评价试剂为 2020年国家药品医疗器械监督抽检中梅毒螺旋体抗体检测试剂盒（免疫层析法）项目各地区抽样试剂，基本覆盖了市面上普遍使用的梅毒螺旋体抗体快速试剂，共计 34 批次，来源于国内 14 个生产企业，分布在北京、福建、浙江、广州等省市，其中 A 厂家11 批次，B 厂家 8 批次，C、D 和 E 厂家各 2 批次，其余厂家均 1 批次，涉及的 TP 抗体快速试剂方法学有乳胶法和胶体金法。
1.2 方法
1.2.1 操作和结果判定 严格按照各试剂的说明书进行样本检测和结果判定。本次试验由 2 人完成，一人负责加样，一人负责结果判读以保证不同试剂之间评价的一致性。对于梅毒螺旋体抗体快速试剂国家参考品按照参考品使用说明书进行检测，即待参考品完全融化，并混合均匀后作为待测样品使用；
如有必要可离心去除沉淀及杂质。参考品的质量标准为：①阴性参考品：阳性反应不得多于2 份，阴性参考品符合率应 ≥ 18/20；
②阳性参考品：阴性反应不得多于 1 份，阳性参考品符合率应 ≥ 9/10；
③最低检出限参考品，L1 应检出阳性，L2 可检出阳性或阴性；
L3 应检出阴性；
④重复性参考品：平行检测 10 次，应均为阳性反应且显色度均一。血清转换盘每支样本检测 1 次，然后统计每一批试剂检测血清转换盘的阳转天数（即检测结果开始出现阳性对应样本的采样时间）。选取2 批次 A 厂家试剂，2 批次 B 厂家试剂，其余厂家各 1 批次，共 16 批次试剂对 51 份临床样本进行检测，若样本不够全部试剂检测，原则为保证每个厂家检测一批次产品。
1.2.2 试剂评分方法 按照满分 100 分分配给三个项目，即检测梅毒螺旋体抗体快速试剂国家参考品项目 40 分，检测血清转换盘项目 30 分，检测 51 份临床样本项目 30 分。其中检测梅毒螺旋体抗体快速试剂国家参考品中的阴性参考品、阳性参考品、最低检出限参考品、重复性参考品各10 分，如果阴性参考品、阳性参考品有任一样本检测不符合扣 1 分，最低检出限参考品 L1 和 L2均为阳性为 10 分，L1 阳性而 L2 阴性判 8 分。检测血清转换盘阳转天数为 31 d 为满分 30 分，第45、48、52 和 59 天分数依次递减 2 分。试剂检测 51 份临床样本的阳性率乘以本项目基础分 30 分为最终试剂检测临床样本项目分数。最终将三个项目得分相加为本次评价试剂的分数。
2.1 34 批次 TP 抗体快速试剂检测梅毒螺旋体抗体快速试剂国家参考品
34 批次试剂检测国家参考品中的阴性参考品、最低检出限参考品和精密度参考品均满足质量标准。其中有 24 批试剂检测 20 份阴性参考品均为阴性，10 批试剂检测结果有 1 份样本假阳性。最低检出限参考品有 21 批试剂检测结果 L1 和L2 均为阳性，13 批试剂仅检出 L1 阳性。对于10 份阳性参考品，有 20 批试剂均检出阳性，9 批试剂检出 9 份阳性，均符合参考品质量标准，但有 5 批试剂仅检测 8 份阳性，不符合参考品质量标准。其中 A 厂家和 B 厂家生产的不同批次试剂检测同一套国家参考品的阴性参考品、阳性参考品和最低检出限参考品结果出现不一致情况，具体结果见表1。
表1 34 批次 TP 抗体快速试剂检测国家参考品结果Table 1 Results of 34 batches of TP antibody rapid reagent testing national reference
2.2 34 批次 TP 抗体快速试剂检测血清转换盘
34 批次试剂中有 3 批试剂最快出现阳转，均在第31 天，有 6 批次试剂最晚出现阳转，均在第59 天，中间相差 4 周时间。阳转天数为 52、45 和 48 d 的分别有 10、8 和 7 批次试剂。其中同为 A 厂家生产的 11 批次试剂，有 3 批次阳转天数为第59 天，1 批次阳转天数为第31 天。具体结果见图1。
图1 34 批次 TP 抗体快速试剂检测血清转换盘阳转天数（A1 ～ 11：A 厂家生产的 11 批次试剂；
B1 ～ 8：B 厂家生产的8 批次试剂；
C1 ～ 2：C 厂家的 2 批次试剂；
D1 ～ 2：D 厂家生产的 2 批次试剂；
E1 ～ 2：E 厂家生产的 2 批次试剂）Figure 1 Days of positive conversion of 34 batches of TP antibody rapid reagents detection serum conversion disk (A1 - 11: 11 batches of reagents produced by manufacturer A; B1 - 8: 8 batches of reagents produced by manufacturer B; C1 - 2: 2 batches of reagents produced by manufacturer C; D1 - 2: 2 batches of reagents produced by manufacturer D; E1 - 2: 2 batches of reagents produced by manufacturer E)
2.3 16 批次 TP 抗体快速试剂检测不同临床时期样本
分别选取 A、B 厂家检测血清转换盘性阳转天数最早和最晚的 A1、A11 和 B1、B8 各 2 批次试剂，其余厂家各 1 批次试剂检测临床样本。对于 8 份一期样本，除了 3、6、8 号样本所有检测试剂均检出阳性外，其余 5 份样本均有试剂未检出，尤其是 1、2 号样本 16 批试剂仅有 4 批和5 批试剂检出阳性。4、5、7 号样本分别有 6、6、4 批样本检为阴性。对于 10 份二期样本，除了1、2 号样本有 1、3 批样本漏检外，其余样本所有检测试剂均检出阳性。5 份三期样本以及 16 份治愈后样本所有检测试剂均检出阳性。12 份潜伏期样本，有一份样本有 2 批次试剂检为阴性，其余所有试剂检测该期样本均为阳性。16 批次试剂检测 51 份临床样本的阳性率为 84.3% ～ 100%，具体结果见表2。
表2 16 批次 TP 抗体快速试剂检测不同临床时期样本结果Table 2 Results of 16 batches of TP antibody rapid reagents for testing samples of different clinical stages
2.4 试剂评分结果
按照拟定的评分方法对检测试剂进行评分，由于只有 16 批次试剂检测了临床样本，因此表3列出了 16 批次试剂的评分结果。总分最高的为A 厂家的 A11 试剂，为 99.4 分，其次为 D 厂家和 L 厂家试剂，分别为 99.0 和 98.0 分。总分最低的为 A 厂家的 A1 试剂，为 83.3 分，其次是B 厂家的 B1 试剂和 H 厂家试剂，分别为 84.5和 85.2 分。
表3 16 批次 TP 抗体快速试剂评分结果Table 3 16 Batch TP antibody rapid reagents scoring results
基于免疫层析法研制的 TP 抗体快速试剂是近几年发展的一种十分简便、快速的梅毒诊断血清学方法，适用于性病门诊的快速检测、街头无偿献血者的筛查以及紧急用血，尤其在资源匮乏地区有很高的经济学效益[10-11]。由于此类试剂技术门槛较低，国内众多企业研制出 TP 抗体快速试剂。2019年之前并无相关国家标准品和行业标准对此类试剂进行质量监管，长期以来我国对于该类试剂仅执行注册检验，且均为使用企业参考品进行注册检验评价，试剂质量差异很大。因此，我们于 2019年研制出梅毒螺旋体抗体快速试剂国家参考品，用于此类试剂的注册检验，以加强试剂的质量监管。从2020年监督抽检的 34 批次试剂检测国家参考品结果来看，85.3% 的试剂符合国家参考品的质量标准，不符合批次的不合格项目均为阳性参考品符合率，集中表现为对弱滴度样本的漏检，一方面可能是因为由于快速检测试剂采用胶体金或硒标记，并用层析技术进行检测，因此该类试剂的灵敏度确实低于酶联免疫法和化学发光法试剂，另一方面可能和试剂未正规评价过早期梅毒感染者样本有关。
典型的梅毒感染进程为先在生殖器出现原发皮损，即硬性下疳，临床称为一期梅毒，下疳常可自然愈合，2 ～ 3 个月无症状的隐伏期后进入二期梅毒，此期的主要表现为全身皮肤黏膜出现梅毒疹，二期梅毒因治疗不当，经过 5年或更久的反复发作而进入三期，主要表现为皮肤黏膜的溃疡性损害或内脏器官的肉芽肿样病变。但大部分梅毒患者并没有典型的皮损表现，即表现为隐性梅毒感染。一、二期梅毒又统称为早期梅毒，此期传染性强，但病程短、破坏性小。三期梅毒又称为晚期梅毒，该期传染性弱，但病程长、破坏性大。隐性梅毒也具有传染性，但病程不明确，跨度很大。梅毒患者经过有效正规的驱梅治疗后其非特异性抗体滴度转为阴性即为梅毒治愈患者，但特异性抗体终身维持阳性。我国在 20 世纪经历了梅毒大流行，目前处于梅毒治愈和隐性期感染人数较多，又考虑到早期梅毒感染者病程短，样本不易收集，因此梅毒检测试剂注册前的临床试验选用早期感染样本较少，所以 TP 抗体快速试剂对早期梅毒感染样本的检测情况并未有效评估，一定程度上影响了试剂的研发。本研究对血清转换盘的检测结果发现34 批次试剂的检测阳转天数相差高达 4 周时间，间接证实了部分试剂对早期感染样本的检测灵敏度较低。对不同临床时期梅毒感染样本的检测结果也可以证实，TP 抗体快速试剂对三期、隐性期及治愈后梅毒感染样本的检测灵敏度较高，一方面是因为此期样本的疾病进程较长，抗体滴度较高，另一方面也说明了由于样本易获得，试剂研发厂家对此期样本验证考核较多。但 TP 抗体快速试剂对一期梅毒感染样本检测灵敏度较低，本研究中处于一期梅毒感染的 1、2 号样本 16 批试剂仅有 4 和5 批试剂检出阳性，还有 3 份样本也有试剂出现漏检，16 批试剂对 51 份临床样本的检出率最低仅达到 84.3%，因此亟需提高 TP 抗体快速试剂对早期梅毒感染者的检出，以有效阻断传播源，控制梅毒流行。
16 批次 TP 抗体快速试剂评分为 83.3 ～99.4 分，90 分以下有 4 家试剂，分数跨度较大，跨度最大的两个试剂来自于同一个生产厂家，一定程度反映了目前国内 TP 抗体快速试剂的质量良莠不齐，而且部分厂家试剂的工艺稳定性也有待改进。所以临床使用时要严格对检测试剂质量进行评估，重点关注对早期样本的检测能力。如果未有效评估不同临床时期样本的检测情况，建议此类试剂主要用于紧急筛查以及资源匮乏地区，有医疗条件的地区可以选用灵敏度更高的梅毒螺旋体血清学试验。
TP 抗体快速试剂对不同临床时期样本检测差异可能还和不同临床时期梅毒样本的抗体谱变化有关，前期我们使用商品化的 WB 试剂对不同临床时期梅毒样本进行检测，分析不同样本对 TP 外膜蛋白中的 TP15、TP17、TP45 和 TP47 蛋白的反应强度，发现抗 TPN45 的抗体在各个时期的反应强度均很高，而其余三种抗体在梅毒一期、二期、三期、治愈后的疾病进程中呈现上升再下降的变化，梅毒早期感染样本 TP15 抗体的反应强度要高于 TP17 和 TP47 抗体[9]，这些变化提示 TP 抗体快速试剂在研发设计时要选择合适的抗原种类以及浓度配比。
综上所述，我国梅毒螺旋体抗体快速试剂在对早期梅毒感染样本检测能力方面需要提高，一方面需要选取覆盖所有疾病进程的样品对试剂进行评价，另一方面需要维持不同批次试剂的工艺稳定性以及运输稳定性，最后要关注梅毒疾病进程中梅毒螺旋体的免疫应答模式，加强 TP 抗体快速试剂的基础研究，从源头提高试剂质量。
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