红花黄色素调节NF-κB/NLRP3信号通路对心肌梗死大鼠心肌细胞焦亡和炎性损伤的影响
时间：2023-06-20 22:00:02 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
赵 雯， 张 勇， 张 波， 安 笑， 陈瑞敏， 任 超
(解放军第九六〇医院， 山东 济南 250031)
心肌梗死(myocardial infarction，MI)是国内外发病率和死亡率最高的心脑血管系统疾病之一，其发病时，导致细胞坏死和组织损伤的心肌缺血是心源性猝死的原因之一[1]。临床上虽已采用ACEⅠ、ARB及β受体阻滞剂等药物来稳定或改善MI患者的心功能障碍，但其预后仍不理想，且长期应用带来的耐药性和不良反应也为临床应用带来挑战。因此，寻找药物减轻MI心肌细胞焦亡和炎性损伤具有重要意义。红花黄色素(Carthamin yellow，CY)是从菊科植物红花花瓣中提取而得，是一种可溶性查尔酮混合物，包括羟基CY A、CY A、CY B、槲皮素、山奈酚等。其中含量最高的是羟基SY A ，是主要的有效成分[2]。因羟基SY A需要对CY进行进一步分离、提纯、纯化等过程，且提取的单体易受到光照、温度而影响稳定性，本实验采用混合物CY作为研究对象。研究发现CY具有抑制血栓形成、抗心肌缺血、降血脂、抗氧化等药理作用[3]。刘广雁等[4]发现CY对心肌细胞H9C2具有保护作用。目前关于CY发挥生物学功能的机制尚不明确，对MI大鼠的心肌细胞焦亡与炎性损伤存在的影响值得研究和探讨。研究表明NF-κB/NLRP3信号通路与细胞焦亡与炎症反应相关，其过度激活可能导致炎症性疾病的发生[5]，但在MI中的作用及其机制尚不清楚。本研究通过结扎左前降支法建立MI大鼠模型，给予CY干预，并予以腹腔注射NLRP3激活剂LPS，观察CY对MI大鼠心肌细胞焦亡和炎性损伤的影响，及NF-κB/NLRP3信号通路在其中的作用机制。
1.1实验动物:SPF级SD大鼠72只，雄性，250g～280g，购自博济医药科技股份有限公司，生产许可证号：SYXK(粤)：2022-0279。实验前饲养于采光良好、通风的实验室，温度(22±1)℃，相对湿度40%～60%，自由饮水、进食。适应性饲养一周后开始实验，本实验已得到本院的动物伦理委员会批准。
1.2主要试剂:红花黄色素(CY)购自于广州威佳科技有限公司；
戊巴比妥钠购自于Sigma公司；
注射用青霉素钠购自瑞阳制药有限公司；
2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)购自于北京索莱宝科技有限公司；
伊文思蓝(EB)购自上海生工生物公司；
NF-κB激活剂LPS购自于美国Peprotech公司；
NLRP3、NF-κB、GSDMD-N、cleaved-caspase1、β-actin抗体及其二抗购自于Abcam公司；
大鼠LDH、IL-1β、IL-18检测试剂盒购自于上海生工生物公司；
RIPA裂解液购自于上海碧云天生物技术有限公司。
1.3MI大鼠模型的建立:参考文献[6]方法，随机选取60只大鼠通过冠状动脉左前降支结扎法建立大鼠MI模型。通过腹腔注射新鲜制备的2%戊巴比妥钠(10mL/kg)来麻醉大鼠。将大鼠固定于仰卧位置，行气管插管，并连接呼吸机，同时进行大鼠心电图监测。于胸骨左侧3～4个肋骨间以20～30度的角做一个1cm长的纵行切口，将胸肌逐层分离后，在大鼠胸部第3-4个肋骨间隙最宽处用眼睑器固定，暴露心脏。随后迅速在大鼠平左心耳底部用6-0号线结扎左前降支近端。最后关闭胸腔，缝合肌肉层，排除胸腔内空气，手术部位用注射用青霉素钠浸润，缝合皮肤。当观察到手术过程中结扎区周围心肌组织发白，心电图J点位置抬高时，说明MI大鼠模型建立成功。共造模成功48只大鼠，随机分为4组，分别是MI模型组(Model组)、低剂量CY组(CY-L组，20mg/kg)、高剂量CY组(CY-H组，40mg/kg)和高剂量CY+NF-κB激活剂组(CY-H+LPS组，CY 40mg/kg+LPS 10mg/kg[7])，每组12只。另取12只大鼠作为对照组(Control组)，12只大鼠作为假手术组(Sham组)。Control组只进行麻醉操作，Sham组麻醉后开胸腔暴露心脏，只穿线不结扎。手术后灌胃给药，CY-L组腹腔注射CY 20mg/kg，CY-H组腹腔注射CY 40mg/kg，CY-H+LPS组注射CY 40mg/kg和LPS 10mg/kg，Control组、Sham组和Model组腹腔注射同等体积的生理盐水。每日一次，共给药28d。
1.4大鼠心电图检查:末次给药后，腹腔麻醉大鼠后行心电图检查。观察并记录各组大鼠左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室收缩压(LV systolic pressure，LVSP)、左室收缩末期容积(LV end-systolic volume，LVESV)、左室短轴缩短率(LV fractional shortening，LVFS)、左室舒张压(LV end-diastolic pressure，LVEDP)、左室舒张末期容积(LV end-diastolic volume，LVEDV)，每个指标均观察并测量3个心动周期，计算出均值。
1.5TTC-EB染色法测定大鼠心肌梗死面积:给药结束后，每组选取6只大鼠处死，经颈总动脉逆行注射0.5% EB溶液1mL，摘除心脏，PBS洗涤后放入-20℃冻存过夜。次日横向将左心室切成厚度越2mm的切片共5片，切片浸入1% TTC溶液(37℃)并孵育20min，之后用多聚甲醛固定，使用ImageProPlus软件计算大鼠心脏切片的梗死面积。染色后观察切片，其中正常心肌呈蓝色，梗死心肌呈白色，缺血心肌呈红色。
1.6苏木精-伊红(HE)和Masson染色观察各组大鼠心肌组织病理学变化:处死剩余大鼠并解剖取出心脏，将小于结扎线 0.5mm 的心肌组织浸于10%甲醛溶液中固定，酒精脱水、石蜡包埋、切片机切片，HE和Masson染色后于观察各组大鼠心肌组织的病理学和纤维化变化。另取余下梗死处及边缘心肌组织剪碎，储存于-80℃。
1.7免疫荧光法检测各组大鼠心肌细胞焦亡:取出1.6中制备的心肌切片，经去石蜡、抗原修复、透化后，然后用2%山羊血清封闭，加入一抗cleaved-caspase1(1∶300)和NLRP3(1∶200)，在4℃环境下孵育过夜。次日于暗处加入相应的二抗溶液(1∶500)并孵育45min，之后在暗处再加入DAPI试剂孵育10min，在荧光显微镜下观察记录焦亡状态的心肌细胞数量，计算焦亡心肌细胞百分比。
1.8检测各组大鼠心肌组织中IL-1β、IL-18和LDH水平:取1.6中冻存的心肌组织，加入冰生理盐水于超声匀浆机中3000 r/min制备10%心肌组织匀浆液。按IL-1β、IL-18和LDH试剂盒说明书检测各组大鼠心肌组织中IL-1β、IL-18和LDH水平。
1.9Westren blot检测各组大鼠心肌组织中NF-κB、NLRP3、GSDMD-N、cleaved-caspase1蛋白的表达:取1.6中冻存的心肌组织，研磨后加入RIPA裂解缓冲液提取心肌组织总蛋白，BCA试剂盒对蛋白定量，经过凝胶电泳、转膜、脱脂奶粉封闭，将膜与一抗NF-κB(1∶2000)、NLRP3(1∶4000)、GSDMD-N(1∶2000)、cleaved-caspase1(1∶3000)及β-actin(1∶5000)4℃孵育过夜；
次日摇床复温，清洗膜，加入相应二抗接着孵育2h。使用ECL显色剂进行显色，经Image Lab软件分析计算各个蛋白条带灰度值，以β-actin作为内参，计算NF-κB、NLRP3、GSDMD-N、cleaved-caspase1蛋白相对表达水平。
2.1各组大鼠心功能指标:与Control组相比，Sham组无统计学意义(P>0.05)。与Sham组相比，Model组大鼠LVEF、LVSP及LVFS降低，LVEDV、LVESV和LVEDP升高，具有统计学差异(P<0.05)。与Model组相比，CY-L、CY-H组大鼠LVEF、LVSP及LVFS显著升高，LVEDV、LVESV和LVEDP显著降低(P<0.05)。与CY-L组相比，CY-H组大鼠LVEF、LVSP及LVFS显著升高，LVEDV、LVESV和LVEDP显著降低(P<0.05)。与CY-H组大鼠相比，CY-H+LPS组大鼠LVEF、LVSP及LVFS显著降低，LVEDV、LVESV和LVEDP显著升高(P<0.05)。见表1。
表1 各组大鼠心功能指标比较
2.2各组大鼠心肌梗死面积比较：Control组和Sham组大鼠无心肌梗死。与Sham组相比，Model组大鼠心肌梗死面积显著增加(P<0.05)；
与Model组相比，CY-L、CY-H组大鼠心肌梗死面积显著减少(P<0.05)；
与CY-L组相比，CY-H组大鼠心肌梗死面积显著减少(P<0.05)；
与CY-H组相比，CY-H+LPS组大鼠心肌梗死面积显著增加(P<0.05)。实验结果见表2、图1。
表2 各组大鼠心肌梗死面积比较
图1 各组大鼠心肌组织TTC-EB染色
2.3各组大鼠心肌组织病理学变化：HE染色和Masson染色切片图如图2、图3所示。Control组和Sham组大鼠心肌细胞排列规则，形态完整，无坏死和炎性细胞浸润，极少量的胶原纤维沉积；
Model组大鼠心肌细胞肿大、排列紊乱，片状坏死，可见大量炎性细胞浸润，大量胶原纤维沉积；
与Model组比较，CY-L组和CY-H组大鼠心肌组织病理损伤减轻，心肌细胞坏死数量减少，炎性浸润减轻，胶原纤维沉积减少；
与CY-H组相比，CY-H+LPS组心肌组织病理损伤严重，细胞大量水肿坏死，胶原纤维沉积增多。
图2 各组大鼠心肌组织HE染色(×200)
图3 各组大鼠心肌组织Masson染色(×200)
2.4各组大鼠心肌细胞焦亡情况比较：Control组和Sham组基本无焦亡心肌细胞。与Sham组相比，Model组心肌细胞焦亡比例显著增加(P<0.05)；
与Model组相比，CY-L组、CY-H组大鼠心肌细胞焦亡比例显著降低(P<0.05)；
与CY-L组相比，CY-H组大鼠心肌细胞焦亡比例显著降低(P<0.05)；
与CY-H组相比，CY-H+LPS组大鼠心肌细胞焦亡比例显著增加(P<0.05)。结果见表3、图4。
图4 大鼠心肌免疫荧光结果(DAPI，×200)注：箭头所指为各组大鼠焦亡心肌细胞
表3 各组大鼠心肌细胞焦亡比例
2.5各组大鼠心肌组织中IL-1β、IL-18及LDH水平比较：与Control组相比，Sham组无统计学差异(P>0.05)。与Sham组比，Model组大鼠IL-1β、IL-18及LDH水平显著升高(P<0.05)；
与Model组相比，CY-L、CY-H组大鼠IL-1β、IL-18及LDH水平显著降低(P<0.05)；
与CY-L组相比，CY-H组大鼠IL-1β、IL-18及LDH水平显著降低(P<0.05)；
与CY-H组相比，CY-H+LPS组大鼠IL-1β、IL-18及LDH水平显著升高(P<0.05)。实验结果见表4。
表4 各组大鼠心肌组织中IL-1β IL-18及LDH水平比较
2.6各组大鼠心肌组织中NF-κB/NLRP3通路相关蛋白表达的比较:与Control组相比，Sham组无统计学差异(P>0.05)。与Sham组相比，Model组大鼠NF-κB、NLRP3、GSDMD-N、cleaved-caspase1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与Model组相比，CY-L组、CY-H组大鼠NF-κB、NLRP3、GSDMD-N、cleaved-caspase1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与CY-L组相比，CY-H组大鼠NF-κB、NLRP3、GSDMD-N、cleaved-caspase1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；
与CY-H组相比，CY-H+LPS组大鼠NF-κB、NLRP3、GSDMD-N、cleaved-caspase1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。实验结果见表5、图5。
图5 各组大鼠心肌组织中NF-κB/NLRP3通路相关蛋白表达的比较注：A：Control组；
B：Sham组；
C：Model组；
D：CY-L组；
E：CY-H组；
F：CY-H+LPS组
表5 各组大鼠心肌组织中NF-κB/NLRP3通路相关蛋白表达的比较
MI是一种严重的冠心病临床类型，在发达国家导致每年超过1/3的患者死亡，是全球死亡和残疾的主要原因之一，给人们生命健康带来威胁[8]。本研究采用冠状动脉左前降支结扎法建立大鼠MI模型，该种模型在传统的徐氏方法基础上进行改良，大大提高了造模成功率。结果显示MI模型组大鼠LVESV、LVEDP、LVEDV升高，LVEF、LVSP、LVFS降低，切片显示心肌梗死面积约为(43.28±3.79)%，提示MI模型大鼠心肌缺血、心功能下降。
细胞焦亡是新定义的一种细胞死亡方式，其与炎症相关。当细胞发生焦亡时，细胞体积增加，细胞膜破裂穿孔，内容物流出，形成活化的焦亡小体，释放炎症因子进而加重炎症反应，致组织损伤和病理学变化[9]。有研究显示，心肌细胞焦亡参与了心衰的发生发展，也在心肌缺血/再灌注损伤中发挥了重要的作用[10]。而关于心肌细胞焦亡是否也参与了MI，目前研究较少。本研究建立MI大鼠模型后发现，Model组大鼠心肌组织中LDH水平增加，说明损伤了心肌细胞膜；
大鼠心肌组织中细胞焦亡所占百分比显著升高(P<0.05)，炎症因子IL-1β、IL-18增多，这些可能引起心肌组织坏死，造成心肌组织炎性损伤。HE染色和Masson染色结果显示心肌细胞肿大、排列紊乱，有大量炎性细胞浸润，并出现大量胶原纤维沉积，这些都是明显的炎性损伤特征。结果说明心肌细胞焦亡在MI发生、发展过程中发挥了重要的作用，且炎性损伤有可能导致了MI和心功能的下降。
目前，中医药因其毒副作用较小，治疗MI疗效确切，将其与西医结合应用于MI已成为医药界研究热点与趋势。CY作为红花的有效成分，市售的注射用红花黄色素在活血化瘀方面的临床效果优于红花。Lu等[11]研究发现CY能通过减少活性氧的释放和炎症反应来保护心脏免受缺血/再灌注损伤；
Guo等[12]发现CY能通过减轻大鼠炎症反应和铁死亡来改善脑缺血/再灌注损伤。但CY在MI中对心肌细胞焦亡和炎性损伤的作用还鲜有报道。本研究结果显示，与Model组大鼠相比，CY-H组大鼠心功能明显改善，心肌组织的炎症损伤和细胞焦亡减弱，IL-1β、IL-18和LDH释放减少，说明CY能减轻MI的炎性损伤。
NLRP3是一种炎症小体复合物，在细胞焦亡中发挥了重要的作用。当细胞受到危险信号后，NLRP3、ASC和pro-caspase1相互组装导致pro-caspase1分解为活性cleaved-caspase1[13]。cleaved-caspase1促进IL-1β的成熟和分泌，诱导了组织炎性损伤。GSDMD被催化裂解为GSDMD-N和GSDMD-C，其中GSDMD-N能导致与炎症相关的细胞焦亡，且GSNMD受到NF-κB的调控。本研究结果显示，与Sham组相比，Model组大鼠心肌组织中NF-κB、NLRP3、GSDMD-N、cleaved-caspase1蛋白表达显著升高(P<0.05)，诱导了心肌细胞炎性损伤和细胞焦亡。与Model组相比，CY-H组大鼠心肌组织中NF-κB、NLRP3、GSDMD-N、cleaved-caspase1蛋白表达显著降低，且减轻了心肌组织炎性损伤和细胞焦亡。推测CY可能通过抑制NF-κB/NLRP3通路减轻MI导致的心肌细胞焦亡和炎性损伤。为了验证此猜想，本研究利用NF-κB的激活剂LPS来干预高剂量CY处理的MI大鼠。结果显示，LPS减弱了高剂量CY对MI大鼠心肌细胞焦亡和炎性损伤的抑制作用。证实了CY可能抑制NF-κB/NLRP3通路，抑制MI大鼠的心肌细胞焦亡，减轻炎性损伤。
综上所述，CY可能通过抑制NF-κB/NLRP3通路，抑制MI大鼠的心肌细胞焦亡，减轻炎性损伤。该研究为开发用于MI临床治疗的新型药物提供了新的思路和方法。然而，该项研究还存在不足之处，NLRP3介导的细胞焦亡可能还涉及了其他通路，还需进一步设计实验进行研究。
猜你喜欢焦亡心肌细胞炎性针刺对脑缺血再灌注损伤大鼠大脑皮质细胞焦亡的影响世界科学技术-中医药现代化(2022年3期)2022-08-22左归降糖舒心方对糖尿病心肌病MKR鼠心肌细胞损伤和凋亡的影响世界科学技术-中医药现代化(2022年2期)2022-05-25miRNA调控细胞焦亡及参与糖尿病肾病作用机制的研究进展医学综述(2022年7期)2022-04-19活血解毒方对缺氧/复氧所致心肌细胞凋亡的影响世界科学技术-中医药现代化(2021年7期)2021-11-04缺血再灌注损伤与细胞焦亡的相关性研究进展昆明医科大学学报(2020年12期)2021-01-26中西医结合治疗术后早期炎性肠梗阻的体会中华养生保健(2020年9期)2021-01-18电针对脑缺血再灌注损伤大鼠海马区细胞焦亡相关蛋白酶Caspase-1的影响世界科学技术-中医药现代化(2020年2期)2020-07-25术后早期炎性肠梗阻的临床特点及治疗中外医疗(2016年15期)2016-12-01心肌细胞慢性缺氧适应性反应的研究进展海南医学(2016年8期)2016-06-08炎性因子在阿尔茨海默病发病机制中的作用中华老年多器官疾病杂志(2016年9期)2016-04-28
