靶向免疫检查点PD-1/PD-L1小分子PET探针的研究进展
时间：2023-06-20 19:35:03 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
代鹏飞 综述 徐慧琴 审校
近年来，免疫检查点[程序性细胞死亡受体蛋白-1/程序性细胞死亡配体蛋白-1(programmed cell death protein-1/programmed cell death ligand protein-1，PD-1/PD-L1)，细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein- 4，CTLA- 4)，淋巴细胞激活基因-3(lymphocyte activation gene-3，LAG-3)等]抑制剂是临床研究最多和发展最快的免疫治疗方法，尤其是PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂受到了研究者广泛关注[1-3]。由于恶性肿瘤在时间和空间存在高度异质性，免疫组织化学方法(immunohistochemistry，IHC)存在一定的局限性[4]。核医学分子影像技术，尤其是PET，可以无创、精确、实时、动态、全面实现在体检测PD-1/PD-L1表达水平，从而有效地筛选出能从PD-1/PD-L1免疫治疗中获益的患者。目前已发展的靶向PD-1/PD-L1免疫检查点PET探针多数属于单克隆抗体和抗体片段的PET探针[5]。然而，这些类型探针由于分子量大、代谢时间长、免疫原性、复杂的制备工艺限制了其在临床上的应用。所以，开发小分子PET探针至关重要。基于目前少有文献总结靶向免疫检查点PD-1/PD-L1多肽和有机小分子PET探针的发展情况，本文主要总结该领域的研究进展，以期为发展新型的靶向PD-1/PD-L1小分子PET探针提供新的思路和带来新的机遇。
PD-1是含有268个氨基酸的诱导表达I型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白B7-CD28超家族成员，经诱导后主要表达于活化的T细胞、B细胞、调节性T细胞、NK细胞和树突状细胞等免疫细胞表面。PD-L1是含有290个氨基酸的I型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白B7超家族成员，主要表达于活化的T细胞、B细胞、抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)、巨噬细胞和多种癌细胞(黑色素瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌等)表面。PD-1与配体PD-L1结合后，PD-1胞内区具有磷酸化作用位点C端氨基酸残基的免疫受体酪氨酸转换基序(immunoreceptor tyrosine-based switch motif，ITSM)，在酪氨酸位点发生磷酸化，募集酪氨酸蛋白磷酸酶SHP-2，从而使下游的脾脏酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，Syk)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)去磷酸化，进而抑制下游的AKT、mTOR、RAS、MEK、ERK等通路的活化，最终抑制T细胞活化、增殖以及细胞因子的分泌。在健康的生物机体内，这种免疫的负调控机制能使机体免于自身免疫应答过强出现的免疫损伤，避免了自身免疫性疾病(系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、胰岛素依赖性糖尿病等)的发生。PD-L1在黑色素瘤、乳腺癌和非小细胞肺癌等癌细胞表面过度表达，从而持续异常地激活免疫检查点PD-1/PD-L1信号通路，进而负性调节免疫应答系统，实现了癌细胞的免疫逃逸，造成了癌细胞的恶性增殖。阻断免疫细胞表面PD-1与癌细胞表面PD-L1的结合，抑制PD-1/PD-L1信号通路的活化，阻断负性调控信号，释放活化T细胞的免疫应答能力，从而修复机体正常免疫反应并控制和清除癌细胞。因此，免疫检查点PD-1/PD-L1信号通路是一个理想的免疫治疗靶点[6]。
迄今为止，全球已经有数十种抗体类PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂获批上市，用于黑色素瘤、结直肠癌、非小细胞肺癌、尿路上皮癌、肾细胞癌和肝癌等癌症的治疗[7]。多项临床试验证实，癌症患者体内PD-1/PD-L1表达水平与其是否能从PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂治疗中获益存在一定的正向相关[8]。目前，PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂总体响应率仅为15%～40%，而且单独使用PD-1单抗抑制剂的总体响应率仅为20%[9]。一项关于派姆单抗(pembrolizumab)用于非小细胞肺癌(NSCLC)的Ⅲ期临床试验表明[10]，患者的客观缓解率(objective response rate，ORR)、无进展生存期(progression-free survival，PFS)和中位生存期(median survival time，MST)与PD-L1表达水平呈正相关。并且，当患者体内PD-L1表达超过50%时，ORR达到45.2%。纳武单抗(nivolumab)用于非小细胞肺鳞癌临床试验表明，PD-L1表达阳性患者的ORR和MST分别为31%和17.2个月，而PD-L1表达阴性患者的ORR和MST仅为9%和10.4个月。2020年NCCN发布的NSCLC指南中，明确指出了不同PD-1/PD-L1表达水平使用不同免疫治疗方案。所以，准确检测PD-1/PD-L1表达水平，可以有效地筛选能从PD-1/PD-L1免疫治疗中获益的患者，对患者进行分层治疗、疗效监测和预后评价具有重要意义。
近年来，靶向免疫检查点PD-1/PD-L1的单克隆抗体、双特异性抗体、纳米抗体、抗体片段、单链抗体、亲合体、Adnectin和类抗体支架蛋白等的PET分子探针到了迅速发展[11-13]，本文概括了一些靶向免疫检查点PD-1/PD-L1抗体类PET探针的情况，见表1。虽然免疫PET显像(Immuno-PET)发展迅速、特异性好，但是相对分子量大、生物半衰期长、免疫原性强、制备困难、需要特殊的基因组编辑技术、肝脏非特异性高摄取等缺陷，使其具有一定的局限性。
相比于单克隆抗体、双特异性抗体、纳米抗体、抗体片段、单链抗体、亲合体和Adnectin等类抗体支架蛋白，小分子多肽和有机小分子化合物具有以下优点：生物体内半衰期短、组织穿透力强、可修饰性强、无免疫原性、合成简单、成本廉价、化学稳定性好、运输便捷和显像时间短等优点[24]。
4.1 核素标记的多肽小分子PET探针WL12是一种由12个氨基酸构成的高亲和性靶向PD-L1环状肽，其半数抑制浓度(half inhibit concentration, IC50)值为20 nmol/L[25]。分子对接相互作用分析表明，WL12在PD-L1的凹槽中形成了β片状结构。WL12的D-亮氨酸类似于PD-1的Ile134插入到疏水性口袋中，其中一个正亮氨酸残基结合方式与PD-1的Ile126结合方式相同。此外，WL12与PD-L1之间存在大量的氢键。有研究者在放射性核素标记多肽小分子抑制剂WL12制备多肽小分子PET探针领域做了大量的工作[26-28]，见表2。
2017年，有研究者将DOTAGA双功能螯合剂连接在WL12多肽上[26]。随后，使用64Cu进行放射性核素标记制备了多肽小分子PET探针[64Cu]WL12。研究显示[64Cu]WL12与PD-L1具有较强亲和力(Kd=2.9 nmol/L)。随后在构建的PD-L1表达阳性和PD-L1表达阴性的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)肿瘤的荷瘤鼠模型中进行PET-CT显像，研究表明，在注射10 min后即可在PD-L1表达阳性的荷瘤鼠模型中观察到[64Cu]WL12的高摄取，可以持续到120 h，免疫组化证实了该结果；
而PD-L1表达阴性的荷瘤鼠模型中并未观察到[64Cu]WL12的高摄取。hPD-L1肿瘤的肿瘤-肌肉和肿瘤-血液比值分别为25.6±1.9和4.7±1。结果表明[64Cu]WL12在注射1 h后，可以特异性检测肿瘤PD-L1的表达水平。
表1 靶向免疫检查点PD-1/PD-L1抗体类PET探针
表2 靶向免疫检查点PD-1/PD-L1小分子PET探针
68Ca的半衰期与WL12多肽的生物半衰期相近，并且68Ga方便获取(68Ge/68Ga发生器)，方便临床工作人员的使用。2018年，De Silva et al[27]用放射性核素68Ca标记DOTAGA-WL12多肽制备了68Ca 标记的多肽小分子PET探针[68Ca]WL12。生物分布实验表明，在所有不同时间点的测试中，[68Ca]WL12在hPD-L1肿瘤中的摄取值是对照组的9倍。在注射15、60、120 min时，hPD-L1肿瘤的每克组织百分注射剂量率(%ID/g)分别为19.4±3.3、11.56±3.18、9.89±1.72；
而对照组肿瘤在注射15、60、120 min时，%ID/g均小于1.33±0.21。相比于[64Cu]WL12，[68Ca]WL12制备方便、具有更适于临床应用的生物半衰期。
18F来源于回旋加速器，实用性更强，更适合于PET成像特性。2019年，Lesniak et al[28]使用[18F]FPy-TFP作为放射性辅基通过与WL12鸟氨酸侧链氨基形成酰胺键，从而制备了18F标记的多肽小分子PET探针[18F]FPy-WL12。PET-CT图像显示，在放射性示踪剂注射10、30和60 min后，hPD-L1肿瘤中[18F]FPy-WL12的摄取值与对照组CHO相比显著增加。在注射10、60、120 min时，hPD-L1肿瘤的%ID/g分别为5.23±1.11、7.16±1.67、8.86±10.2；
而对照组肿瘤%ID/g均小于1.77±0.21。然而研究发现肝脏和肾脏对[18F]FPy-WL12摄取率较高。
2022年，Zhou et al[29]利用68Ca标记的多肽小分子WL12制备了PET探针68Ga-NOTA-WL12，同时进行了人体研究，结果表明，在体外和体内PD-L1表达阳性肿瘤中，均表现特异性摄取68Ga-NOTA-WL12；
生物分布实验表明，68Ga-NOTA-WL12主要分布在肝、脾、小肠和肾；
在注射1 h后，肿瘤清晰可见，尤其是肺，1 h时肿瘤/肺比值为4.45±1.89。
4.2 核素标记的有机小分子PET探针近年来，随着小分子抑制剂与PD-1/PD-L1蛋白作用模式的研究，越来越多的分子(磺酰胺类、联苯类、噁二唑类、苄苯醚类等)已经用于抑制免疫检查点PD-1/PD-L1的结合[30]。
2015年，美国百时美施贵宝公司在申请的专利中披露了具有抑制PD-1/PD-L1结合活性的联苯类化合物[31]。受此启发，2020年,Miao et al[32]合成了结构上类似于BMS-1166的化合物LN2。通过铜催化的炔基和叠氮的点击反应(Husigen环加成反应)将硼氨酸引入到化合物LN2中，制备成含硼氨酸LN。最后，基于18F-19F同位素交换制备成有机小分子PET探针[18F]LN。实验结果表明，[18F]LN与PD-L1具有较强亲和力(Kd = 65.27±3.47 nmol/L)。同时在建立的PD-L1阳性(A375-hPD-L1)和PD-L1阴性(A375)的荷瘤鼠模型中显像。结果表明，在注射15 min后，在PD-L1阳性(A375-hPD-L1)的荷瘤鼠肿瘤摄取值为(1.96±0.27)%ID/g；
在PD-L1阴性(A375)和阻断组的荷瘤鼠肿瘤摄取值分别为(0.89±0.31)%ID/g和(1.07±0.26)%ID/g。研究分析，通过点击反应引入亲脂性的AMBF3降低了探针对PD-L1的亲和力，从而造成非靶器官的非特异性摄取。
为了改善探针的亲水性，2021年,Lv et al[33]基于醛和羟胺缩合策略，使用[18F]FDG代替AMBF3作为标记辅基标记有机小分子L7制备了[18F]LG-1。[18F]FDG结构的引入显著提高了[18F]LG-1的水溶性，其Log Do/w比[18F]LN低4.8倍。体外实验表明，PD-L1表达阳性细胞(A375-hPD-L1)摄取明显高于PD-L1表达阴性细胞(A375)。体内动态PET图像表明，在注射60 min后，在PD-L1阳性(A375-hPD-L1)的荷瘤鼠肿瘤摄取值是PD-L1阴性(A375)荷瘤鼠肿瘤的2.6倍。总之，[18F]LG-1是一种潜在的靶向PD-L1的有机小分子PET探针。
研究[4]表明有创的IHC在检测PD-1/PD-L1表达水平方面存在局限性：① 检测阈值不同；
② 容易受到干扰素、淋巴细胞趋化因子和前期治疗等因素影响；
③ 无法实时、重复和动态监测PD-1/PD-L1表达。靶向PD-1/PD-L1免疫检查点PET探针可以高效地实现活体检测PD-1/PD-L1表达水平。相比于抗体类PET探针，小分子PET探针具有生物体内半衰期短、化学稳定性好、无免疫原性和成本廉价等优点。然而，PD-1与PD-L1接触的界面具有高度平坦且疏水的结构，没有小分子结合的合适位点，导致PD-1/PD-L1免疫检查点小分子抑制剂研究进展缓慢。由于缺乏高活性的PD-1/PD-L1小分子抑制剂，使得靶向免疫检查点PD-1/PD-L1小分子PET探针的研究进展更加缓慢。
