盐酸药根碱对HPV16,E6/E7－HaCaT细胞中NF－κB及C2TA蛋白的影响

戴任金铭，时晨，李秀，商婷婷，任青玲✉

（1.南京中医药大学附属江苏省中医院，江苏 南京 210000；
2.南京中医药大学中医儿科研究所，江苏 南京 210000）

研究发现，宫颈癌的明确病因是高危型人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）的持续感染［1］，由HPV 感染导致的宫颈癌约占70%～80%［2］。尽管液基细胞学检测等宫颈筛查手段以及HPV 疫苗的问世降低了疾病发生率及恶性进展率，但此类疾病发病率在我国仍然处于上升阶段［3］。由于病毒E6/E7 蛋白介导的免疫逃逸现象，导致HPV 持续感染（HR－HPV）并进展成为宫颈鳞状细胞癌的风险大幅度增加［4］，目前临床尚未有特异性治疗宫颈HPV 感染的药物。

HPV 是小型、无包膜DNA 病毒，通过多种途径进行免疫逃逸，包括E6、E7 蛋白抑制细胞因子及趋化因子分泌，妨碍抗原提呈功能等。上皮细胞是病原体感染后的第一道防线，HPV 具有强烈的嗜上皮属性，角质形成细胞是其天然的宿主细胞［5］，作为表皮的主要成分，角质形成细胞上表达多种模式识别受体（pattern recognition receptor，PRRS），此类受体可以识别包括病毒、脂多糖、肽聚糖、鞭毛蛋白在内的病原相关模式，导致产生促炎细胞因子和趋化因子，如IL－1β、IL－8 和CCL20 分泌，随后将白细胞募集到损伤部位，发挥免疫杀伤作用［6−8］。角质形成细胞上还存在主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ、Ⅱ类分子，识别处理抗原并分别将病毒抗原特异性呈递给CD4+、CD8+T 细胞，激活效应T细胞，产生大量促炎细胞因子［9−11］。然而HPV E6、E7 蛋白作为非分泌性蛋白在上皮细胞中低表达，借此逃避抗原提呈细胞的识别，使其能顺利整合到宿主基因组以促进疾病恶性进展。目前关于宫颈HPV感染导致宫颈鳞状细胞癌的机制研究主要集中于病毒E6、E7 蛋白，大量研究数据表明E6、E7 蛋白显著抑制核转录因子NF－κB激活，IL－6、IL－1β等细胞因子的释放，这些均使白细胞无法被正常募集到感染部位进行免疫应答，最终帮助HPV 实现免疫逃逸［4，12］，为肿瘤的发展提供有益微环境。C2TA 作为NLRs 家族NLRA 的唯一成员，主要负责调控MHC Ⅱ类分子的表达，与CD4+CTL免疫杀伤机制密切相关。

课题组前期研究发现，盐酸药根碱是加味二妙颗粒君药黄柏主要成分之一［13］，目前对其研究主要集中在抗菌及抗肿瘤等药理学作用上［14］，但该药物在治疗人乳头瘤病毒导致的宫颈鳞状细胞癌中具体作用机制尚不明确。本研究通过生物信息学手段筛选宫颈鳞状细胞癌组织与正常组织中C2TA 表达差异（C2TA 的低表达不利于宫颈鳞状细胞癌患者生存），随后通过体外实验使用慢病毒构建HaCaT－HPV16 E6/E7 稳定表达细胞模型，旨在研究HPV16 E6/E7 蛋白引起的免疫逃逸过程中盐酸药根碱的药理学作用以及与C2TA 及NF－κB通路相关的生物学机制。

1.1 仪器

细胞培养箱（美国，ThermoFisher）；
高速冷冻离心机（德国，Eppendorf，5810R）；
蛋白核酸分析仪（德国，Eppendorf，Bio Photometer）；
垂直流超净工作台（德国，ESCO）；
7500 实时 定量PCR 仪（美国，ABAppliedBiosystems，QUANTSTUDIO 7 FLEX QUANTSTUDIO）；
多功能酶标仪（瑞士，TECAN，M200 PRO）；
电泳槽（美国，Bio－Rad，Mini PROTEAN Tera Cell）；
湿转转膜仪（美国，Bio－Rad）；
蛋白印迹－多功能成像系统（美国，Bio－Rad，ChemiDoc MP）；
转移摇床（中国，海门市其林贝尔仪器有限公司）。

1.2 试剂

盐酸药根碱（南京良纬生物科技有限公司，批号：B21451）；
DMEM 完全培养基（江苏凯基生物有限公司，批号：KGM12500H－500）；
0.25% 胰蛋白酶－EDTA酶（美国Gibico公司，批号：25200－056）；
胎牛血清（美国Corning 公司，批号：35－081－CV）；
CCK－8（上海翌圣生物科技有限公司，批号：40203ES60）；
NF－κB、IKB－α（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：10745－1－AP、10268－1－AP）；
C2TA（上海艾比玛特生物医药公司，批号：TP71691）；
p－NF－κB、羊抗鼠/兔二抗（美国CST 公司，批号：3033T、7074）；
β－actin（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：66009－1－Igs）；
SuperECLPlus 超敏发光液（上海天能公司，批号：180－501）；
慢病毒载体pLenti－Ⅲ－HPV16E6－IRESE7Vector（Puro）（镇江爱必梦生物科技有限公司，ABM）；
Viral Plus Transduction Enhancer（镇江爱必梦生物科技有限公司，批号：No.G698）；
Polybrene（镇江爱必梦生物科技有限公司，批号：No.G062）；
HPV16 E6、E7 及GAPDH 引物（镇江爱必梦生物科技有限公司，ABM）；
RNA 抽提试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，批号：RC－101）；
逆转录试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，批号：R312－01）；
Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，批号：Q712－02）；
蛋白裂解液RIPA（上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0013B）；
BCA 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0010S）。

2.1 数据库及单基因生物信息学分析

Timer 数据库是常用的癌症免疫浸润标志物数据库之一，使用基因模块分析C2TA 表达水平与肿瘤组织中浸润的B 细胞、CD4+T 细胞、CD8+T 细胞、巨噬细胞、树突状细胞和嗜中性粒细胞间的关系；
利用GEPIA数据库在相关性分析模块中分析C2TA 表达在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达及其与临床患者预后间的关系，以及免疫细胞标志物间是否具有相关性。

2.2 细胞培养

HaCaT细胞在10%胎牛血清+DMEM 完全培养基条件下生长。HaCaT 购自江苏凯基生物技术有限公司，HEK293T细胞由ABM公司提供。

2.3 HaCaT 细胞系慢病毒感染复数（MOI）值确定、Puromycin（Puro）筛选浓度摸索及内源性E6/E7基因检测

添加Viral Plus Transduction Enhancer 和Polybrene作为感染增强剂，慢病毒感染HaCaT 细胞72 h 记录HaCaT 细胞图片。设置MOI 梯度分别为0、5、10、20、50、100，pLenti－CMV－CBH－GFP－2A－Puro－BlankVector 慢病毒感染HEK293T 作为阳性对照组。HaCaT 细胞以20%密度培养在含Puromycin 的培养基中，培养72 h 后记录HaCaT 细胞形态，Puromycin 浓度范围为0～5 µg/mL。使用5XAll－In－OneRT Maste rmix with EXCellent CTLysis Kit 提取HaCaT 细 胞RNA并进行cDNA 合成，对cDNA 样品分别使用人源HPV16 E6、E7和内参GAPDH 的特异性引物进行RTPCR。Lenti－Ⅲ－HPV－16 E6/E7（Puro）载体质粒转染的293T 细胞（293T－HPV）和野生型293T 细胞（293T－WT）为对照。

2.4 慢病毒包装

适当完全培养基平铺细胞于10 cm2培养皿中，将细胞置于含5% CO2的37 ℃温箱中孵育24 h后开始转染。将pLenti－Ⅲ－HPV－16E6－IRES－E7Vector（Puro）和 Lenti－ComboPackingMix、lentifectin 共转染 至HEK293T中，完成转染后置于含5% CO2的37 ℃温箱孵育。8 h 后吸去培养基，加入37 ℃预热的完全培养基，继续将细胞放置温箱孵育，72 h后收集细胞上清，此时为未纯化的病毒液，浓缩纯化处理以获取高滴度慢病毒保存液，置于−80 ℃冰箱保存。所获得的慢病毒定名为Lenti－Ⅲ－HPV－16E6－IRES－E7Virus（Puro）。

2.5 稳定表达HPV16 E6/E7 基因HaCaT 细胞系的建立

在6 孔板中接种密度约为20%～30%的HaCaT 细胞，24 h 后用慢病毒感染HaCaT 细胞，在5%的CO2，37 ℃条件下孵育48 h，将感染后的HaCaT 细胞铺板96 孔板进行稳转株抗性筛选，筛选培养基为添加终浓度0.2 µg/mL Puromycin 的完全培养基。筛选3 周后，选择合适克隆进行扩增，RT－qPCR法筛选阳性克隆。

2.6 Cell Counting Kit−8（CCK－8）筛选最佳给药浓度

将100 µL 各组细胞（5 × 104/mL）接种至96 孔板，每组设置6 个复孔，置于5% CO2、37 ℃、饱和湿度培养箱 中培养，过 夜后分别 加入0.001、0.05、0.2、1、5 µmol/L 盐酸药根碱，接种后第24、48 h 分别终止培养。向各孔中加入10 µL 的CCK－8 溶液，继续培养4 h，用酶标仪在450 nm波长下检测各组细胞的OD值。

2.7 实时荧光定量聚合酶链式反应分析转录水平变化

参照RNA抽提试剂盒说明书要求抽提总RNA。应用紫外分光光度仪测定A260/A280 比值及浓度，A260/A280 比值在1.8～2.0 之间为符合纯度要求。由上海生工生物科技有限公司依据荧光定量PCR引物设计原则设计并合成引物，引物序列见表1。参照逆转录试剂盒说明书操作，进行逆转录获得cDNA产物，置于−20 ℃冰箱中保存。按照试剂盒说明书进行操作扩增。采用2−ΔΔCT法对RT－qPCR结果进行数据处理。

表1 引物序列

2.8 蛋白免疫印迹（Western blot）法检测C2TA 及NF－κB信号通路相关蛋白

Western blot 法检测细胞中C2TA、NF－κB、p－NF－κB、IKB－α 蛋白表达。6 孔板中细胞每孔加入80 µL RIPA 裂解液，裂解液中按50∶1的比例加入蛋白酶抑制剂与磷酸酶抑制剂，冰上裂解，静置10 min，4 ℃，12 000 r/min 离心10 min，取上清液，BCA 蛋白定量试剂盒检测总蛋白浓度，再取适量蛋白加5 × Loading buffer 100 ℃加热10 min，获得样品，−20 ℃保存。通过10% SDS－PAGE80V，30 min，110 V，60 min分离，使用湿转转膜系统400 mA，90 min 转移到PDVF膜，1 × TBST洗涤3次，每次10 min，后封闭液封闭2 h。加入稀释的一抗（稀释倍数均为1∶1 000），摇床4 ℃ 孵育，次日1 × TBST 洗膜3 次，每次10 min。加入二抗（1∶5 000），摇床室温孵育2 h。再用1 × TBST 洗膜3 次，每次10 min。使用超敏发光液试剂检测。用Image Lab 软件处理各条带的灰度值，以目的蛋白与β－actin的灰度比值作为目的蛋白的相对含量。

2.9 统计学方法

数据处理采用GraphPad Prism 9.00统计软件。数据以±s表示。多组间比较，如符合正态分布且方差齐，用多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用多因素方差分析法，两两比较采用单因素方差分析；
若数据不符合正态分布或方差不齐时则用非参数检验。P＜ 0.05表示差异具有统计学意义。

3.1 C2TA表达水平与宫颈鳞状细胞癌患者预后的相关性

在线数据库GEPIA 对C2TA 进行相关生存分析，Kaplan－Meier 生存分析发现C2TA 表达水平降低的宫颈鳞状细胞癌患者OS较差。结果见图1。

图1 GEPIA数据库中C2TA与宫颈鳞状细胞癌患者预后不良的相关性

3.2 C2TA表达水平与宫颈鳞状细胞癌免疫浸润细胞及标志物的相关性

C2TA 表达水平与宫颈鳞状细胞癌纯度、免疫B 细胞、CD4+T 细胞、CD8+T 细胞、巨噬细胞、树突状细胞和嗜中性粒细胞相关。结果见图2。在此基础上，探究 C2TA在宫颈鳞状细胞癌免疫调节中的作用，进一步使用 GEPIA 数据库发现在宫颈鳞状细胞癌组织中C2TA的表达水平与HLA－DMA，HLA－DOB、HLA－DPA1、HLA－DRA、HLA－DPB1、CD74、HLA－DOA、RP11－876、HLA－DQA1等相关。结果见表2。

图2 C2TA表达水平与宫颈鳞状细胞癌纯度和免疫细胞的相关性

表2 TIMER数据库中宫颈鳞状细胞癌组织中的表达水平与C2TA表达水平之间的相关性

3.3 HaCaT－HPV16 E6/E7过表达模型的建立

挑取HPV16 E6和E7基因及阴性对照慢病毒转化后的阳性重组克隆，抽提质粒DNA 后行酶切鉴定。结果显示，pLenti－Ⅲ－HPV16E6－IRES－E7Vector（Puro）载体转化菌落的酶切鉴定产物分别为487 bp和307 bp，片段大小和预期一致。所获慢病毒载体重组克隆测序结果显示HPV16 E6/E7基因序列与基因库人编码HPV16 E6/E7基因的序列完全吻合。在荧光显微镜下可观察到在阳性对照慢病毒感染后HaCaT细胞中大量绿色荧光蛋白表达，提示慢病毒包装成功，且MOI=20 感染效率80%～90%，细胞存活率80%（见图3a），抗性筛选得知Puromycin浓度达到0.2 µg/mL时HaCaT 细胞死亡率为99%，以此浓度进行稳转株的抗性筛选（见图3b）。RT－PCR 结果表明，实验细胞HaCaT 中HPV16 E6、HPV16 E7 基因均无表达。经过抗性筛选的HaCaT 稳转株RNA 经RT－PCR 后条带大小与预期符合，HPV16 E6/E7 基因经慢病毒介导后成功整合至宿主细胞基因组且被成功转录成mRNA（见图3c），表明稳定表达HPV16 E6/E7 的HaCaT 细胞株建立。

图3 慢病毒感染HaCaT细胞实验

3.4 盐酸药根碱对HPV16 E6/E7 导致的促炎细胞因子的影响

研究使用CCK－8 确定给药浓度，HaCaTHPV16 E6/E7 细胞经盐酸药根碱给药（0.001、0.05、0.2、1、5 µmol/L）后细胞活力均受影响（P＜ 0.05），且呈明显的时间和剂量依赖关系，在给药5 µmol/L 时细胞存活率约50%。结果见表3。因此，本试验选定5 µmol/L 作用24 h 作为盐酸药根碱给药组。C2TA、核转录因子NF－κB 及IL－6、IL－8、IL－1β、TNF－α 等促炎细胞因子mRNA 水平明显受到抑制，随后给予盐酸药根碱后得到恢复，与模型组相比差异具有统计学意义。结果见表4。

表3 各组HaCaT－HPV16 E6/E7细胞活力的比较（±s，n =3）

表3 各组HaCaT－HPV16 E6/E7细胞活力的比较（±s，n =3）

注：与24 h存活率比较，1）P ＜ 0.05。

表4 各组HaCaT－HPV16 E6/E7细胞 NF－κB、IL－6、IL－8、TNF－α mRNA表达的比较（±s，n =3）

表4 各组HaCaT－HPV16 E6/E7细胞 NF－κB、IL－6、IL－8、TNF－α mRNA表达的比较（±s，n =3）

注：与对照组比较，1）P ＜ 0.05；
与模型组比较，2）P ＜ 0.01。

3.5 盐酸药根碱对C2TA蛋白及NF－κB通路的影响

与模型组相比，盐酸药根碱处理组中C2TA的蛋白表达均呈上升趋势（P＜ 0.01）。NF－κB、P－NF－κB、IKB－α是NF－κB通路中的关键蛋白，其激活促进细胞因子IL－6等表达，有利于将白细胞募集到受感染部位传递免疫信号，激活固有免疫应答清除病原体。与对照组相比，NF－κB、P－NF－κB、IKB－α 表达明显下降（P＜ 0.01），而盐酸药根碱干预后呈现回调趋势，这说盐酸药根碱的作用机制可能与NF－κB通路以及C2TA蛋白有关，通过激活C2TA蛋白、NF－κB通路及细胞因子释放提高上皮细胞识别HPV 癌蛋白E6/E7 的敏感性。结果见图4和表5。

表5 各组HaCaT－HPV16 E6/E7细胞中C2TA、p－NF－κB、NF－κB、IKB－α蛋白表达的比较（±s，n =3）

表5 各组HaCaT－HPV16 E6/E7细胞中C2TA、p－NF－κB、NF－κB、IKB－α蛋白表达的比较（±s，n =3）

注：与对照组比较，1）P ＜ 0.01；
与模型组比较，2）P ＜ 0.01。

图4 各组HaCaT－HPV16 E6/E7细胞C2TA、p－NF－κB、NF－κB、IKB－α蛋白表达电泳图

人乳头状瘤病毒是常见的生殖道病原体，HRHPV 为宫颈鳞状细胞癌的发展提供有利条件［15］，E6/E7 是目前已知的两类存在于宫颈鳞状细胞癌中的病毒蛋白［16］。在上皮细胞的分化过程中E6/E7 通过影响促炎细胞因子分泌、上皮细胞黏附能力在内的多种途径帮助病毒基因组顺利整合到宿主内［17］。研究表明，E6、E7 的表达影响NF－KB 通路以及下游促炎细胞因子的激活，而细胞因子的分泌对于宿主免疫识别至关重要［18］。研究认为，由于细胞因子的分泌对T 淋巴细胞受体（T cell receptor，TCR）识别病毒抗原，激活CTL 中的关键作用，HPV 感染后微环境中低水平表达的细胞因子与宫颈上皮瘤变进展相关［3］。MHC Ⅱ类分子的丢失对于免疫逃逸并不是必需的。但最近的研究数据表明，C2TA 可以调节Fas 配体或IL－4 等基因的表达，可能是参与免疫逃逸的关键步骤［19］。因此，推测C2TA 可通过间接效应改变肿瘤生长、肿瘤进展或免疫逃逸［20−21］。

HPV E7蛋白通过多种途径干扰递呈抗原，其中包括直接干扰高尔基复合体的内环境，导致病毒抗原肽难以被MHC 类分子识别或提呈至T 细胞受体［22］。此外，还包括病毒蛋白的低表达、影响干扰素作用，抑制细胞因子［23］、趋化因子［24］、黏附分子［25］表达等途径，通过这些机制逃避免疫识别、杀伤。近期C2TA 在病毒感染中的作用备受瞩目［26−27］，C2TA是NLRs家族NLRA的唯一成员，对MHC Ⅱ类的转录激活物发挥主要调控作用［28−29］，低表达的C2TA 限制MHC Ⅱ分子将病毒蛋白肽正常提呈给CD4+T细胞，一方面导致下游NF－κB信号通路活化受限，另一方面导致细胞因子及趋化因子分泌异常，以上均能帮助病毒逃避CTL 的免疫杀伤［30］。在一项对埃博拉病毒和SARS 样冠状病毒的研究中，研究人员利用转座子介导的基因激活筛选方法发现C2TA 通过激活第二个基因CD74 的表达，诱导人细胞系对病毒产生抵抗力［9］。有研究表明［9，31−32］，C2TA的低表达导致MHC Ⅱ类分子表达下调，从而干扰CD4+CTL，使上皮细胞对病毒蛋白抗原多肽处于无应答状态，具体表现为NF－κB信号通路失活以及IL－6、IL－8、TNF－α 等细胞因子的表达受限。我们推测在HPV16 E6、E7 蛋白干扰细胞因子分泌过程中C2TA 发挥关键作用，通过恢复C2TA 的表达或许能够逆转这一趋势，增强免疫应答反应。药根碱是从黄连等植物中分离出来的一种四氢异喹啉生物碱，其结构与小檗碱相似，具有解毒杀菌降血糖的作用。在对黄连中4 种生物碱成分进行分析时发现药根碱的抑菌作用最为明显［33］，研究发现宫颈HPV 的感染与患者阴道菌群失衡密切相关［34］，阴道菌群失衡导致上皮细胞屏障功能受限，无法正常对病毒抗原肽进行免疫应答，也有利于病毒实现免疫逃逸［35］。

本实验通过生物信息学手段发现C2TA 的低表达与宫颈鳞状细胞癌患者的不良生存情况之间存在联系。随后进行体外实验验证，利用慢病毒载体在角质形成细胞HaCaT上成功构建HPV16 E6/E7共同稳定表达的细胞株，旨在研究HPV16 E6、E7 蛋白协同致病机制，盐酸药根碱给药实验试图阐明盐酸药根碱在HaCaT 细胞中恢复免疫激活通路NF－κB 相关促炎细胞因子IL－6、IL－8等表达的作用。通常，宿主一旦检测到病原相关分子模式（pathogen－associated molecular patterns，PAMPs），将会触发细胞内抗病毒信号级联，诱导NF－κB信号通路激活和各种促炎细胞因子例如IL－6、IL－8、IL－1β 及TNF－ α 等的表达［18，28，36］，然而RT－PCR 结果显示，IL－6、IL－8 等细胞因子在HPV16 E6/E7 过表达后受到的抑制，这提示E6、E7蛋白干扰上皮细胞免疫调节的能力可能与细胞因子分泌受限有关。为了探索E6、E7蛋白引起细胞因子分泌减少的具体机制，通过Western blot 法验证的C2TA 蛋白的表达，发现C2TA 在E6、E7 蛋白过表达后呈下降趋势，以上说明细胞因子分泌减少确与C2TA之间存在联系。此外，实验发现HPV16 E6/E7 蛋白不仅抑制了细胞模型中C2TA 蛋白的表达，还干扰了NF－κB 通路的激活，这一现象说明HPV16 E6、E7 蛋白可能通过限制C2TA 的表达以及干扰NF－κB 通路激活影响细胞因子的分泌，抑制上皮细胞免疫反应的敏感性。

综上所述，盐酸药根碱可能通过上调HaCaTHPV16 E6/E7 细胞中C2TA 表达及激活NF－κB 调节人乳头瘤病毒16 型E6/E7 蛋白抑制促炎细胞因子分泌，恢复上皮细胞分泌促炎细胞因子。

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