从“脾之液为涎”探讨岭南特色炮制枳壳的减燥作用及机制研究❋
时间：2023-06-18 12:25:04 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
龙江玲， 黄莹莹， 杨 婷， 李沁如， 徐启键， 赵婷秀， 夏 荃△
(1.广州中医药大学中药学院， 广州 510006；
2.广州中医药大学基础医学院， 广州 510006)
中药药性理论是中药理论体系的基础与核心[1]。“燥性”是中药性能之一，但目前有关中药燥性的研究相对较少[2]。炮制可以改变或调整药性，探究中药炮制前后的差异、阐释可能的药性变化规律是研究中药药性的思路之一[3]。枳壳是一味常用中药，来源于芸香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培变种的干燥未成熟果实，具有理气宽中、行滞消胀的功能[4]。一般认为生枳壳“燥性”过强，久服易伤阴耗液，故常通过炮制达到缓和“燥性”的目的[5]。在广东、香港等岭南地区，多采用先发酵后蒸制的炮制工艺以缓解枳壳的“燥性”[6]，但对于这种岭南特色炮制枳壳减燥作用的相关研究并不多见。
有研究发现，长期高剂量服用生枳壳后，大鼠会出现24 h粪便量减少等表现，故从影响肠道燥性的角度出发，论述了枳壳的燥性以及麸炒减燥的作用[7]。但本课题组在前期研究中发现，生枳壳所致大鼠肠道燥性的症状并不明显，但可影响大鼠的唾液量、饮水量和胃肠道神经肽含量。枳壳归脾、胃经，中医藏象理论认为“脾在液为涎”，故本实验从影响唾液分泌和唾液腺神经肽的角度，探讨岭南特色炮制枳壳的减燥作用，也为中药燥性的研究提供思路。本研究通过广州中医药大学实验动物伦理委员会批准(批号ZYD-2020-137)。
1.1 动物
SPF级雄性SD大鼠30只，体质量(200±20)g，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号SYXK(粤)2019-0202。动物饲养于广州中医药大学中药学院SPF级动物房，光照12 h明暗交替，室温22 ～ 24 ℃，湿度40% ～ 60%，普通饲料喂养，自由进食饮水，常规适应性饲养1周后开始实验。
1.2 药物
生、制枳壳饮片(批号200501)，购自广州至信中药饮片有限公司，经广州中医药大学中药鉴定教研室张丹雁教授鉴定，确认为芸香科植物酸橙的干燥未成熟果实的合格饮片。
1.3 主要试剂与仪器
戊巴比妥钠(广州市齐云生物技术有限公司，货号GH-40C0)；
苏木精、伊红(北京索莱宝科技有限公司，货号G1108、G1140)；
血管活性肠肽(vasoactive peptide，VIP)试剂盒、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)试剂盒、P物质(substance P，SP)试剂盒、水通道蛋白5(aquaporin5，AQP5)试剂盒(江苏酶免生物科技有限公司，货号分别为MM-0445R1、MM-0442R1、MM-0444R1、MM-0474R1)；
DAB显色试剂盒(中杉金桥有限公司，货号212300304)；
AQP5抗体(英国Affinity公司，货号AF5169)；
山羊抗兔IgG(江苏亲科生物研究中心有限公司，货号7074S)。
MICROM STP 120型石蜡脱水机、HISTOSTAR型石蜡包埋机、HM304E型石蜡切片机、A81500101型自动染片机，美国赛默飞世尔科技有限公司；
BX53型光学显微镜，日本奥林巴斯有限公司；
Multiskan Go 1510型全波长酶标仪，美国赛默飞世尔科技有限公司；
LUKYM-1型样品冷冻研磨仪，广州露卡测序仪器有限公司；
3-18R型台式高速冷冻离心机，湖南可成仪器设备有限公司。
2.1 生、制枳壳水煎液的制备
取一定量生、制枳壳饮片加水煎煮2次，第1次加入10倍量水，浸泡30 min后煎煮1 h；
第2次加入8倍量水煎煮30 min，合并2次滤液，减压浓缩至含生药量1 g/mL，4 ℃冷藏备用。
2.2 分组及给药方法
30只SD大鼠随机分为空白组、生枳壳低剂量组、生枳壳高剂量组、制枳壳低剂量组、制枳壳高剂量组，生、制枳壳给药剂量按照大鼠与人的等效剂量换算公式计算。空白组大鼠给予1 mL/100 g 0.9%氯化钠溶液，生、制枳壳低剂量组大鼠按1 g/kg剂量灌胃，生、制枳壳高剂量组大鼠按10 g/kg剂量灌胃，每天给药1次，连续给药4周。
2.3 处死与取材
末次给药后禁食不禁水12 h，大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，剂量为0.5 mL/100 g。麻醉后剪开大鼠颈部皮肤，摘取双侧颌下腺，用0.9%氯化钠溶液冲洗干净，一侧颌下腺固定于4%多聚甲醛中用于HE染色和免疫组化，一侧组织匀浆用于Elisa检测，取材后脱颈处死大鼠。
2.4 指标检测
2.4.1 大鼠饮水量测定 将大鼠单独饲养于代谢笼中，每天定时添加饮水并测定水瓶总质量，以前1天水瓶总质量M1与当天水瓶总质量M0的差值作为大鼠的每日饮水总量，连续测定28 d大鼠的日饮水量，计算每组大鼠饮水量均值。
2.4.2 大鼠唾液流率的测定 在给药后第7天、第14天、第21天、第28天测定每只大鼠的唾液流率。将大小适当的洁净小棉球进行称重，获得棉球的干重，然后将棉球塞入大鼠口颊内，放置3 min后取出，立即使用电子天平获得棉球的湿重，再按公式计算出唾液分泌量和唾液流率。唾液分泌量(mg) = 棉球的湿重(mg) - 棉球的干重(mg)；
唾液流率(mg/min) = 唾液分泌量(mg)/3。
2.4.3 大鼠颌下腺指数的测定 取出颌下腺后，用0.9%氯化钠溶液洗净，滤纸擦干表面多余的液体后称重，颌下腺指数=颌下腺质量(g)/大鼠体质量(g)。
2.4.4 HE染色观察颌下腺病理学变化 将颌下腺组织固定24 h后常规脱水，石蜡包埋。用切片机将其切成4 μm厚的切片，HE染色，光学显微镜下观察颌下腺组织病理学变化。
2.4.5 Elisa法测定颌下腺VIP、5-HT、SP、AQP5含量 根据试剂盒说明书步骤，Elisa法测定大鼠颌下腺组织中VIP、5-HT、SP、AQP5的含量。
2.4.6 免疫组化法测定颌下腺AQP5蛋白表达 石蜡切片置于柠檬酸盐缓冲液(pH=6.0)中进行抗原修复后，加入适量的内源性过氧化物阻断剂，滴加AQP5一抗(1∶100)4 ℃孵育过夜。再加入辣根过氧化物酶标记的二抗，37 ℃孵育30 min后，加入DAB显色液在室温下孵育30 s，终止染色，苏木精复染细胞核后中性树胶封片。采用Image-pro plus 6.0软件分析颌下腺组织棕黄色区域的平均光密度值，计算AQP5蛋白表达水平。
2.5 统计学方法
3.1 各组大鼠饮水量比较
表1示，与空白组比较，各给药组大鼠的饮水量均升高(P<0.01)；
各给药组之间比较，生枳壳高剂量组大鼠的饮水量升高最明显(P<0.01)，即制枳壳也可升高大鼠饮水量但相较于生枳壳高剂量组，大鼠饮水量明显降低(P<0.01)。生、制枳壳高剂量组大鼠的饮水量均高于低剂量组且呈剂量依赖性。
表1 枳壳炮制前后对各组大鼠饮水量的影响
3.2 各组大鼠唾液流率比较
表2示，与空白组比较，生枳壳组和制枳壳高剂量组大鼠的唾液流率显著降低(P<0.01，P<0.05)，与制枳壳低剂量组比较差异无统计学意义；
与生枳壳高剂量组比较，制枳壳组大鼠唾液流率升高(P<0.01，P<0.05)；
生、制枳壳高剂量组大鼠的唾液流率均低于低剂量组且呈剂量依赖性。
表2 枳壳炮制前后对各组大鼠唾液流率的影响
3.3 各组大鼠颌下腺指数比较
表3示，与空白组比较，其他给药组大鼠的颌下腺指数均有所降低。相较于生枳壳组，制枳壳组大鼠的颌下腺指数升高，但各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。
表3 枳壳炮制前后对各组大鼠颌下腺指数的影响
3.4 各组大鼠颌下腺组织病理学观察结果
图1示，空白组大鼠颌下腺浆液腺数量较多且密集，呈正常的卵状形，导管无扩张，无淋巴细胞浸润；
生枳壳低剂量组大鼠颌下腺浆液腺数量有所减少，腺泡形态改变，而生枳壳高剂量组大鼠颌下腺腺泡数量明显减少且大小不一，腺泡形态由卵形变为长条形。与生枳壳组比较，制枳壳组大鼠颌下腺泡数量增加，且制枳壳高剂量组明显多于制枳壳低剂量组，腺泡结构有所改善。
图1 各组大鼠颌下腺组织病理学观察结果比较(HE×400)
3.5 各组大鼠颌下腺神经肽VIP、5-HT、SP含量比较
表4示，与空白组比较，生枳壳组大鼠颌下腺VIP和5-HT含量均降低，其中生枳壳高剂量组显著降低(P<0.05，P<0.01)；
与生枳壳高剂量组比较，生、制枳壳低剂量组大鼠颌下腺中VIP含量均明显升高(P<0.05)，制枳壳高剂量组大鼠颌下腺中5-HT含量明显升高(P<0.05)，各给药组大鼠颌下腺中SP含量比较差异无统计学意义。
表4 枳壳炮制前后对各组大鼠颌下腺神经肽VIP、5-HT、SP含量影响
3.6 各组大鼠颌下腺组织AQP5含量比较
表5示，与空白组比较，生枳壳组大鼠颌下腺中AQP5含量显著降低(P<0.01，P<0.05)，制枳壳组大鼠颌下腺AQP5含量升高，其中制枳壳高剂量组AQP5含量明显升高(P<0.05)；
与生枳壳高剂量组比较，制枳壳组大鼠AQP5含量明显升高(P<0.01，P<0.05)。
表5 枳壳炮制前后对各组大鼠颌下腺AQP5含量影响
3.7 各组大鼠颌下腺组织AQP5的免疫组化染色结果
图2示，空白组大鼠颌下腺中AQP5分布在腺泡的顶膜、侧膜及基膜，表现为较强染色的棕黄色颗粒。与空白组比较，其他实验组大鼠颌下腺染色降低，其中生枳壳低、高剂量组大鼠颌下腺阳性染色显著降低(P<0.01，P<0.05)，差异有统计学意义；
与生枳壳高剂量组比较，制枳壳低、高剂量组棕黄色颗粒明显增多(P<0.05)。
燥性是中药固有的性能之一。燥能除湿是中药发挥的治疗作用，但燥性太过会使机体损耗津液，引起干燥失润的表现[8]，如《证治要诀》中提到的“凡辛温燥烈之品无不伤阴耗血之弊”。但是，不同药物燥性伤阴的具体表现有差异。如本课题组在前期研究中发现，生枳壳给药后，大鼠肠道燥性的表现不明显，但唾液分泌减少、饮水量增加等症状显著。在临床中也观察到部分患者服用枳壳后会有口渴、咽干等不适症状。
注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；
与生枳壳高剂量组比较，#P<0.05；
与生枳壳低剂量组比较，ΔP<0.05；
AQP5(aquaporin5，水通道蛋白5)图2 各组大鼠颌下腺AQP5的免疫组化染色比较(×400)
中医称唾液为涎、唾，由于二者都分泌于口，临床实际中很难截然分开，故常合而称之[9]。《素问·宣明五气篇》曰：“五脏化液……脾为涎。”脾主运化水谷与水湿精微，若功能失常则会导致涎液分泌异常[10]。枳壳归脾胃经，生枳壳辛燥峻烈，易耗伤津液、损伤中气，经炮制后可缓和燥性，增强其理气健脾的功效[11]。故本实验基于“脾在液为涎”的理论，从影响唾液分泌和唾液腺神经肽的角度探讨岭南特色炮制枳壳的减燥作用。
在本实验中发现，高剂量的生枳壳可使大鼠的唾液分泌量降低、饮水量增加，表现出燥性耗液伤津的症状；
相比于生枳壳，制枳壳可使大鼠唾液分泌量增加，饮水量降低，说明枳壳炮制后能够缓解其生品的燥性。
唾液分泌的生理机制较为复杂，受多种因素调控和影响，其中颌下腺神经肽和水通道蛋白的表达是重要的影响因素[12]。VIP是体内重要的血管活性肽，可增加颌下腺局部的血管流量，直接影响唾液的分泌，同时也可通过磷酸化途径调控颌下腺中环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)信号通路，从而间接影响唾液的分泌[13]。5-HT分布于大鼠颌下腺导管、浆液性腺泡、副交感神经节等部位，对唾液的分泌起着重要的作用，5-HT含量的升高可使大鼠唾液分泌量增加[14]。SP存在于颌下腺组织颗粒曲管内，是有效的舒张血管活性物质，可维持颌下腺腺泡形态和功能，参与调节颌下腺腺泡液体的分泌[15]。在本实验中，生枳壳高剂量可明显降低大鼠颌下腺VIP和5-HT含量，结果表明生枳壳所致唾液分泌量的减少与VIP和5-HT含量降低有关，且呈现剂量依赖的负相关性；
制枳壳低剂量组大鼠颌下腺VIP含量高于生枳壳低、高剂量组，制枳壳高剂量组大鼠颌下腺5-HT含量明显高于生枳壳高剂量组，结果提示制枳壳可通过调控VIP和5-HT含量使大鼠唾液分泌量增多，从而缓和生枳壳的燥性。在各组间大鼠颌下腺中SP含量差异无统计学意义，说明生、制枳壳影响大鼠唾液分泌的作用机制可能与SP含量无关。
唾液的分泌不仅与颌下腺神经肽含量的改变有关，还与颌下腺中水通道蛋白的表达有关。其中AQP5是最早被确定分布在唾液腺腺泡顶膜、侧膜、闰管和导管上皮细胞中的一种蛋白，AQP5的异常表达和分布被认为可能是唾液分泌失调的重要因素之一[16]。在本实验中发现，生枳壳组大鼠颌下腺中AQP5的表达降低且呈剂量依赖；
给予制枳壳后，AQP5表达升高，大鼠唾液分泌量升高，提示制枳壳炮制减燥的作用机制可能与升高AQP5表达有关。
综上所述，大鼠唾液分泌减少、饮水量增加等表现，为枳壳“燥性”的重要生物学表征，其内在机制可能与颌下腺神经肽及水通道蛋白的分泌与表达异常有关。枳壳经岭南特色炮制方法炮制后，可以在一定程度上纠正这些异常，起到炮制缓燥的作用。本研究既是炮制原理的初探，也可为中药药性理论、“脾在液为涎”等中医基础理论的研究提供一些思路。但是研究目前只关注了枳壳炮制前后对颌下腺分泌功能的影响，关于枳壳的“燥性”尚需更深入的研究，如燥性物质基础的明晰、全面的燥性生物学表征的构建等，都是值得思考与探究的问题。
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