不同抗性泡核桃对褐斑病病原菌侵染的生理生化响应
时间：2023-06-17 09:00:05 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
王 芳，肖 玉，糜加轩，时羽杰，万雪琴，杨汉波
(长江上游林业生态工程四川省重点实验室，长江上游森林资源保育与生态安全国家林业和草原局重点实验室，四川农业大学 林学院，生态林业研究所，成都 611130)
核桃是胡桃科(Juglandaceae)胡桃属(Juglans)所有种的种子的统称，具有很高的营养价值和保健作用，在中国各地广泛栽植[1-2]。泡核桃(Juglanssigillata)是核桃中的一种，是中国山区重要的经济林树种，主要种植于西南部及中部地区，该品种种植单一，管理粗放，病害问题日益严重[3]。褐斑病是危害核桃的三大病害之一，爆发性较强、遍布范围极广，而且严重危害核桃的叶片、嫩梢和果实，严重降低核桃产量和质量[4-5]。此外，使用化学药品对核桃褐斑病进行防治会使病原菌产生抗药性，也会污染环境，并且农药残留会增加食品风险。因此，采用抗病品种无疑是最安全有效的方法，培育和推广抗病品种是防治褐斑病的最有效、最经济的绿色途径之一。而明确不同抗性核桃品种对褐斑病的抗性生理机制，对防治褐斑病的发生、品种利用以及制定有效的抗病育种策略具有重要意义。研究表明，植物遭受病原菌侵染后会产生大量活性氧(ROS)，抑制植物叶绿体发育，造成细胞膜脂过氧化，致使细胞死亡；
为减轻ROS对细胞的损害，植物体内会发生复杂的生理生化反应，产生多种物质，清除体内过多的ROS，抵抗病原菌的入侵，增强植物的抗性[6-7]。这些物质包括过氧化物酶(peroxidase, POD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase, PAL)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)等防御酶及非酶类物质(叶绿素、总酚等)，并且这些物质的变化与植物的抗病性有关[8-10]。例如，水稻遭受白发病侵染后，抗病品种中抗氧化酶活性及可溶性糖含量升高且显著高于感病品种[11]；
灰霉病侵染苹果时抗病品种中类黄酮和木质素含量显著高于感病品种[12]；
抗病马铃薯抵抗疮痂病侵染过程中POD和PPO活性逐渐升高，这两种酶活性与马铃薯抗病性呈正相关关系[13]；
向日葵感染核盘菌后，抗病品种中可溶性蛋白含量降低，但仍显著高于感病品种，MDA含量与抗病性呈负相关[14]。由此可见，植物遭受逆境胁迫后的生理生化指标变化与植物的抗病性有一定的关系。
据报道，引起核桃褐斑病的病原菌种类复杂多样，核桃日规壳(Ophiognomonialeptostyla)就是引起褐斑病的病原菌之一，学者对该病原菌与核桃的反应机制、感病后核桃酚类物质含量的变化以及该病原菌的繁殖特性等进行了研究[4,15-16]， 但主要是围绕黑核桃(Juglansnigra)和英国核桃(Juglansregia)等展开，缺少与泡核桃相关报道。而缺乏泡核桃品种抗病性选择相关的策略，极大程度限制了泡核桃抗病育种的进程。研究寄主植物受病原菌侵染后的生理生化变化，对揭示植物抗性生理基础有着重要意义。2020年，本课题组首次从泡核桃病叶中分离、鉴定得到核桃日规壳病原菌，并验证其是导致泡核桃褐斑病的主要致病菌[17-18]，目前尚缺乏泡核桃抵抗该病原菌侵染的生理生化反应的相关研究。鉴于此，本研究以抗、感褐斑病的泡核桃无性系为实验材料，考察了褐斑病病原菌侵染对不同抗性无性系叶片中抗氧化酶活性及叶绿素、总酚等含量的影响，探讨不同抗病性泡核桃对褐斑病病原菌响应的差异，以期为揭示泡核桃抗褐斑病的生理机理、泡核桃抗病机理研究和抗病品种选育及遗传改良提供理论基础。
1.1 供试材料和菌株
供试植物材料为4年生抗病(199)和感病(64)泡核桃(Juglanssigillata)无性系。供试菌株为本课题组前期从泡核桃褐斑病病斑分离、鉴定的核桃日规壳(Ophiognomonialeptostyla)SICAUCC 20-0012菌株[17-18]。
1.2 实验设计与生理指标测定
1.2.1 孢子悬浮液的制备在超净工作台内，将培养10 d左右的核桃日规壳菌株倒入少量无菌水，用无菌玻璃棒轻轻刮下孢子，再用孔径为75 mm的无菌尼龙布过滤掉菌丝及其他杂质，使用血球计数板，将孢子悬浮液的浓度调至107个/mL，备用。
1.2.2 接种方法将配置好的分生孢子悬浮液装入喷壶中，采用针刺喷洒接种法对健康、无缺陷的叶片进行接种(图1)。接种前叶片用0.6%的次氯酸钠消毒、灭菌，无菌水冲洗，接种后叶片用塑料袋密封保湿24 h。抗病和感病无性系均接种6株(6个生物学重复)，同时抗病和感病无性系均设置空白对照(6株，接种无菌水)，总共24株。每株东南西北四个方向各接种10枝，每个枝上除了顶端、末端的叶片，其他成熟叶片均接种。分别在接种后1、5、9、16、27和34 d采集核桃叶片。每个时间点，每株上取长势一致的5片叶片混合为1个样品。所有的样品液氮速冻，-80 ℃保存备用，用于后续生理生化指标测定。
A为处理组接种；
B为空白对照组接种图1 接种方法示意图A represents the inoculation of the resistant/susceptible clone treatment group, B represents the blank control groupFig.1 Graphical explanation of inoculation method
1.2.3 叶片带菌率调查计算将新鲜叶片用无菌解剖刀切割为1 cm×1 cm的方块，置于含有1.5 g/L三氯乙酸[V(乙醇)∶V(氯仿)=3∶1]的脱色液中脱色24 h，期间更换脱色液2次至脱色液不再变色，然后将脱色后的叶片转入饱和水合氯醛(2.5 g/mL)中透明24 h。待组织透明后用水洗净，经稀苯胺蓝的水溶液(0.01 g/mL)染色 5 min，用甘油做浮载剂于显微镜OLYMPUS BX51下观察、记录[19]。统计不同时期单张叶片的病原菌数量(每个无性系10张叶片)，最后计算叶片单位面积病原菌数量，即单位面积带菌率(个/cm2)。
1.2.4 生理生化指标测定超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用氮蓝四唑光还原法；
过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚法；
抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性测定采用紫外比色法[20]。过氧化氢酶(CAT)活性测定采用紫外吸收法[21]。苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定采用反式肉桂酸升高速率计算的方法; 多酚氧化酶(PPO)活性测定采用邻苯二酚比色法[22]。
丙二醛(MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸法；
可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法；
可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法；
叶绿素含量测定采用丙酮法[21]。类黄酮含量测定采用甲醇法[23]。总酚含量参照总酚提取试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书进行提取，并采用紫外分光光度计测定吸光度值，根据公式计算含量。每个生理生化指标重复测定3次，取其平均值。
1.3 数据处理
采用Excel 2010进行数据整理，SPSS 26.0软件进行统计分析，对不同时期下的数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，并采用最小显著差异法(LSD)进行多重比较检验差异显著性。采用GraphPad Prism 8.0软件进行可视化作图。文中所得数据均以平均值±标准差表示。
2.1 接种后两个泡核桃无性系叶片带菌率比较
表1显示，接种褐斑病病原菌后，泡核桃抗病无性系199叶片带菌率在各时间段内均显著低于感病无性系64(P<0.05)。同时，在整个侵染时段内，抗病无性系199叶片带菌率无明显变化，带菌率在3.45～3.93个/cm2之间；
而感病无性系64在接种9 d后叶片带菌率显著上升，34 d时带菌率最高(10.27个/cm2)。可见，泡核桃感病无性系叶片表面更有利于病原菌生长和繁殖，叶片带菌率显著较高。
表1 接种后两个泡核桃无性系叶片带菌率变化情况
2.2 接种病原菌对泡核桃无性系叶片防御酶活性的影响
2.2.1 抗氧化酶活性在接种病原菌后，泡核桃抗、感病无性系叶片的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)及抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性均随着侵染时间的增加表现出先升高后降低的趋势，且它们的SOD、POD和APX活性均在16 d时达到最高，抗、感病无性系分别为198.04/237.26、354.45/145.48和0.23/0.17 U/g，而CAT活性则分别在接种后16 d和27 d达到最大值(图2)。其中，抗病无性系接种和对照处理叶片的SOD活性始终低于相应的感病无性系，并且大多时期存在显著差异(P<0.05)；
与对照相比，感病无性系叶片SOD活性在接种后1 d、5 d时显著降低，而抗病无性系则在接种9、24 d时显著增加，34 d时显著降低，它们在其余时间段均无显著变化。同时，抗病无性系接种和对照处理叶片POD和APX活性在各时段也均不同程度地高于感病无性系，并且大多时期存在显著差异(P<0.05)；
与对照相比，感病无性系POD活性在接种后1和34 d显著降低，在9～16 d显著升高，其APX活性在接种5～16 d均显著升高，其余时段无显著变化；
抗病无性系POD活性在接种后9 d比对照显著降低，在16～34 d均显著升高，其APX活性在接种5～9 d均显著升高，在接种34 d显著降低，其余时段无显著变化。另外，接种病原菌后，感病无性系CAT活性在接种5 d显著低于相应抗病无性系，在接种9～34 d均显著高于抗病无性系；
与对照相比，感病无性系CAT活性在接种1～5 d时显著降低，在接种16～34 d显著升高，而抗病无性系CAT活性在接种5和34 d显著降低，在接种9和27 d显著升高。可见，接种褐斑病菌均会使两个无性系叶片内抗氧化酶活性发生不同方向、不同程度的变化。
2.2.2 PPO和PAL活性图2显示，两个无性系对照组叶片中的PAL活性在整个接种期间没有发生明显变化，抗病无性系叶片PAL活性只有在接种5 d时才显著高于感病无性系(P<0.05)，其余时间无差别；
两无性系各时期接种组与对照组之间也均无显著差异。抗、感无性系接种后PPO活性均呈现先上升后下降的趋势，且感病无性系PPO活性达到峰值的时间较早。其中，在接种初期(1～9 d)，感病无性系 PPO活性逐渐增加，并在接种9 d时达到最大值后急速下降，并且感病无性系PPO活性在接种5和9 d时显著高于对照组，其余时间段无显著变化；
而抗病无性系PPO活性在接种前期(1～16 d)无明显变化，并于27 d时急剧上升达到最大值(85.8 U·mg-1·min-1)，且显著高于感病无性系。可见，两个泡核桃无性系均能通过增强PPO活性对病原菌进行响应，而其PAL活性无显著变化。
T199、CK199 、T64、CK64分别表示抗病无性系199和感病无性系64接种处理和对照；
误差棒指的是平均值的标准误；
同期不同小写字母表示处理间在0.05水平存在显著性差异；
下同图2 抗感无性系接种病原菌核桃叶片后防御酶活性变化T199, CK199, T64 and CK64 stand for the inoculation treatment and control of resistant clone 199 and susceptible clone 64, respectively; Error stick refers to the standard error of average value. The different normal letters in the same time indicate significant difference between treatment group and blank control group at 0.05 level; the same as belowFig.2 Changes of defense enzyme activities in walnut leaves after inoculation of resistant/susceptible clones with pathogens
2.3 接种病原菌对泡核桃无性系叶片丙二醛(MDA)含量的影响
如图3所示，在接种核桃褐斑病病原菌后，泡核桃抗病无性系叶片MDA含量变化比较平缓，且仅在接种5 d时显著低于对照，其余时期与对照组均无显著差异，其在接种34 d时达到峰值。感病无性系叶片 MDA含量在接种后先增加后降低，在接种5 d时达到峰值(5.48 mmol/g)并显著高于同期对照，而在34 d时显著低于对照。感病无性系叶片 MDA含量在接种后1～9 d显著高于抗病无性系，在接种16～27 d无显著差异，在接种34 d显著低于抗病无性系。可见，泡核桃抗病无性系199叶片MDA含量在遭受病原菌侵染后不会发生显著变化，感病无性系叶片MDA含量则会在接种初期显著增加，并显著高于抗病无性系，其达到峰值的时间明显早于抗病无性系。
图3 抗感无性系接种病原菌后核桃叶片MDA含量的变化Fig.3 Changes of MDA content in resistant/susceptible clones after inoculation in walnut leaves with pathogens
2.4 接种病原菌对泡核桃无性系叶片叶绿素含量的影响
由图4可知，泡核桃抗、感无性系叶绿素含量在接种褐斑病病原菌后均呈现先增加后降低的趋势，且抗病无性系在整个侵染时期始终高于感病无性系且大多差异显著；
抗、感病无性系叶绿素含量分别于接种27 d和9 d含量达到峰值，分别为3.84和2.74mg/g，即抗病无性系达到峰值的时间较晚、峰值较高。与对照相比，抗、感无性系叶绿素含量在接种1～16 d均与对照无显著差异，感病无性系在接种27～34 d显著低于对照，抗病无性系在接种27 d显著高于对照，在34 d时显著低于对照。可见，病原菌侵染后期会显著降低泡核桃感病无性系叶绿素含量，却会诱导抗病无性系叶绿素合成，提高叶绿素含量，以利于其抵抗病原菌的入侵。
图4 抗/感无性系接种病原菌核桃叶片后叶绿素含量的变化Fig.4 Changes in chlorophyll content of resistant/sensitive clones after inoculation in walnut leaves with pathogens
2.5 接种病原菌对泡核桃无性系叶片渗透调节物质含量的影响
如图5所示，泡核桃抗、感病无性系叶片可溶性蛋白含量在接种病原菌后均呈现先降低后增加的趋势，且两个无性系均在接种34 d达到峰值；
抗病无性系叶片可溶性蛋白含量在接种27 d时显著高于同期对照(P<0.05)，其余时间无显著变化，而感病无性系在接种16 d时显著低于其对照组，接种27 d时显著高于其对照组，其余时期无差别；
抗、感无性系叶片可溶性蛋白在接种16 d时存在显著差异，且抗病无性系显著高于感病无性系(P<0.05)。同时，接种病原菌后，抗病无性系叶片可溶性糖含量在接种1和5 d显著低于感病无性系，34 d显著高于感病无性系；
与对照组相比，抗病无性系可溶性糖含量在接种5和27 d显著降低，在34 d显著升高，而感病无性系可溶性糖含量在接种1 d显著降低，其余各时期变化并不显著。可见，病原菌侵染后期均会使泡核桃抗、感病无性系积累少量可溶性蛋白和可溶性糖，增强植物的抗病性，参与抵抗病原菌的侵染过程。
图5 抗/感无性系接种病原菌后核桃叶片渗透调节物质含量的变化Fig.5 Changes of osmotic adjustment substances in resistant/susceptible clones after inoculation in walnut leaves with pathogens
2.6 接种病原菌对泡核桃无性系叶片酚类等抑菌相关物质含量的影响
图6显示，接种后5～34 d，泡核桃抗病无性系叶片的类黄酮含量均显著低于相应的感病无性系(P<0.05)，且抗、感两个无性系叶片类黄酮含量均在接种9 d时达到峰值，分别为0.64和0.78 mg/g；
与对照组相比，抗病无性系类黄酮含量在接种9 d时显著升高，在接种16和34 d时显著降低，而感病无性系在接种27 d时显著升高，34 d时显著降低，其余时间段无显著变化(图6)。同时，接种后抗病无性系叶片总酚含量始终显著低于相应的感病无性系(P<0.05)；
抗病无性系接种后总酚含量整体变化不大，在接种9 d达到峰值(51.01 mg/g)，而感病无性系的总酚含量呈现上升趋势，在接种27 d时达到峰值(87.11 mg/g)。与对照组相比，抗病无性系接种16 d时显著降低，而感病无性系接种27和34 d时显著升高。可见，病原菌更容易诱导感病无性系64产生较多的总酚和类黄酮，抑制病原菌的繁殖。
图6 抗/感无性系接种病原菌后酚类抑菌物质含量的变化Fig.6 Changes in the contents of phenolic antibacterial substances after inoculation with pathogens bacteria in resistant/susceptible clones
酶的防御反应作用是植物抵抗病原菌侵染的最基本反应，研究表明超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)等防御酶对植物的抗病性有重要作用[24-26]。
植物受到病原物侵染时，会通过苯丙烷类代谢途径合成木质素、类黄酮、植保素等抗菌物质，参与抵抗生物或微生物胁迫[31]。总酚和类黄酮是苯丙烷代谢途径产生的能够抑制病原菌生长和繁殖的物质，其含量的高低与植物的抗病性也有一定关系[12,28,32]。本研究中，接种褐斑病病原菌16 d以后，泡核桃感病无性系64叶片类黄酮和总酚含量高于抗病无性系199，说明感病无性系在受到褐斑病侵染后，可能通过增加叶片中总酚和类黄酮含量对病原菌进行响应，减少自身细胞损伤程度。而PPO可以通过苯丙烷类代谢途径产生这两种物质，接种后感病无性系叶片PPO活性也增加，可以将PPO及其相关代谢物质(类黄酮、总酚)的变化看作是植株感病后组织内部发生的“生化症状”，这种内部“生化症状”和外部病症是统一的[33]。所以，可以利用感病无性系染病后PPO活性升高、类黄酮和总酚含量变化大，而抗病无性系变化小的特点，作为筛选抗病品种的指标。另外，接种褐斑病病原菌后，泡核桃感病无性系64叶片表面病原菌的数量始终增加并且显著多于抗病无性系199，表明感病无性系更有利于病原菌生长繁殖和入侵，叶片的防御系统不能有效抵御病原菌入侵，从而加重叶片损害程度，因此就需要产生较多的总酚和类黄酮来抑制病原菌的繁殖，故类黄酮和总酚含量也相对较高。本研究仅对叶片表面的病原菌数量进行了观察，而抗病和感病无性系叶片内部是否有病原菌的入侵或繁殖尚不清楚，可能侵入叶片内部的病原菌对核桃的抗性影响更大，所以病原菌与核桃互作的机制还有待于进一步研究探讨。
植物在逆境胁迫下的细胞膜损伤可以根据受影响组织中丙二醛(MDA)的含量来判断，MDA在植物抗性方面已有很多研究，与植物抗病性呈负相关关系，含量越高说明细胞损伤越严重[11,34-35]。本实验中，泡核桃抗病无性系接种褐斑病病原菌后MDA含量并无明显变化，可能是因为其叶片产生的一些生理活性物质或防御酶及早地发挥作用，具有较强的清除ROS的能力，引起生物膜损伤的程度小，增加了其抗性；
而感病无性系64在病原菌侵染后叶片MDA含量增加，是由于发挥防御作用的酶活性较低，不能及时清除过量ROS，使细胞膜脂过氧化严重。
此外，植物的光合作用离不开叶绿素，而叶绿素含量的高低又与植物抗病性紧密相关，大量研究结果均表明叶绿素含量越高，植物的抗病性就越强[36-37]。本研究发现，接种褐斑病病原菌后，泡核桃抗病无性系叶片叶绿素含量始终高于感病无性系，且达到峰值的时间较晚。说明病原菌侵染后，抗病无性系叶片会积累大量叶绿素，增强自身的光合作用效率，合成较多有机物质提高自身新陈代谢速度，增强植物的抗性；
而感病无性系的自我调节能力低于抗病无性系，叶绿素合成途径受阻，叶片损伤严重，表现出明显的病症，进一步证明叶绿素含量的变化与植物抗病性有关。另外，可溶性糖和可溶性蛋白质是植物体内重要的渗透调节物质，在植物的抗病性方面发挥着重要作用[27,31,38]。本研究发现，泡核桃接种褐斑病病原菌后可溶性蛋白和可溶性糖含量变化较平缓，且差异并不明显；
在接种后期抗、感病两个无性系可溶性蛋白和可溶性糖含量逐渐增加，说明病原菌侵染后期才会影响植物的渗透调节系统，增加这两种调节物质积累，抵抗病原菌的入侵，且这两种物质含量的高低与泡核桃的抗病性强弱无关。
综上所述，褐斑病病原菌侵染会影响抗、感泡核桃叶片的生长发育、抗氧化系统和渗透调节系统的功能。接种褐斑病病原菌后，泡核桃感病无性系更容易受到病原菌侵染，其叶片表面病原菌的数量始终增加并且显著多于抗病无性系。抗病无性系通过增加SOD、POD、APX和PPO的活性以及积累较多叶绿素、可溶性蛋白和可溶性糖进而抵御病原菌的侵染；
感病无性系通过提高CAT和PPO活性来增加总酚及类黄酮含量，从而减轻自身过氧化程度，抑制病原菌生长。这些均表明抗、感泡核桃无性系应答核桃日规壳病原菌胁迫的生理生化反应各不相同，在今后的研究中还应从遗传、分子角度等深入研究泡核桃的抗病机理，进一步从基因水平上解析泡核桃的抗病机制。
