miR-504调控蛋白酶体激活因子抑制人乳腺癌细胞系MCF-7增殖及迁移
时间：2023-06-15 21:35:02 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
杨良权，于 淼，姜 茜，张明慧，杨海松
1.秦皇岛市妇幼保健院 乳腺外科，河北 秦皇岛 066000；
2.贵州医科大学附属医院 乳腺外科，贵州 贵阳 550004
乳腺癌(breast cancer)是全球性女性癌相关疾病死亡的主要原因[1-2]，现阶段化学药物疗法仍是乳腺癌治疗的重要组成部分[3]，但随后导致的复发和转移，仍是乳腺癌诊断和治疗面临的主要临床挑战。
MicroRNA(miRNA) 是20 nt左右长度的一类ncRNA，在多种肿瘤中发挥重要作用。研究显示在乳腺癌中miRNA特异性表达参与调节癌细胞的增殖、凋亡、自噬以及迁移等。miR-200 b通过调节人乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231参与乳腺病理进程[4]。miR-99a通过靶向调控HOXA1抑制乳腺癌细胞侵袭[5]。miR-34家族可抑制p53介导的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)，抑制乳腺癌的转移和进展[6]。特异性miR-504异常表达与多种肿瘤发生发展相关，本研究通过数据库预测发现蛋白酶体激活因子复合体亚基 3(proteasome activator subunit 3， PSME3)是miR-504的潜在靶点，但miR-504与PSME3在乳腺癌中的作用机制暂未发现，故本研究拟通过小鼠模型中miR-504对肿瘤生长的影响，并分析miR-504调控PSME3对乳腺癌细胞生物学行为的影响，最终阐明miR-504在乳腺癌中的作用机制。
1.1 样本、细胞与试剂
乳腺癌组织标本和癌旁组织标本来自秦皇岛市妇幼保健院88例接受手术的乳腺癌患者，以上标本涉及的所有患者均签署知情同意书，并获得本院伦理委员会批准(批准号202100012)。
人乳腺癌细胞系MCF-7(中国科学院上海生命科学院细胞资源中心)；
Western blot检测试剂盒(上海雅酶生物科技有限公司)；
PCR相关试剂、引物、检测试剂盒(Invitrogen公司)；
PSME3、Ki67抗体(Abcam 公司)；
CCK-8试剂盒(HyClone公司)；
胎牛血清(ClarkBio公司)。BALB/c裸鼠(北京大学实验动物中心)。
1.2 方法
1.2.1 细胞的培养和转染分组处理：将MCF-7细胞保存在RPMI1640培养基中，含10%胎牛血清，l00 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素，在37 ℃，5% CO2中培养。转染前24 h，将MCF-7细胞接种于6孔板，将细胞分为NC组、miR-504mimics组、miR-504 mimics+ PSME3组，按照转染试剂说明书对细胞进行转染。
1.2.2 乳腺癌小鼠移植瘤模型：选取12只5周龄左右BALB/c裸鼠，随机分为NC组(n=6)，miR-504 mimics组(n=6)。用miR-NC或miR-504 mimics转染MCF-7细胞24 h后，收集细胞，皮下注射到裸鼠左前上肢腋下处皮下，每只裸鼠接种细胞数为1×106个/只。3周后处死小鼠，去除小鼠肿瘤组织并称重。
1.2.3 免疫荧光实验检测裸鼠瘤体组织中Ki67阳性信号：将组织切片脱蜡入水，微波加热法修复抗原，温度94 ℃左右，10～15 min， 5%的正常羊血清封闭，37 ℃孵育60 min。弃去血清，加入一抗(PSME3抗体和Ki67抗体)，4 ℃过夜。加入二抗，常温避光孵育60 min。弃二抗，荧光显微镜观察拍照。
1.2.4 数据库预测miR-504潜在靶基因：使用TargetScan数据库预测miR-504和PSME3的结合位点。
1.2.5 双荧光素酶报告基因实验检测荧光素酶活性：构建野生型PSME3 3′-UTR(PSME3-Wt)质粒和突变型PSME3 3′-UTR(PSME3-Mut)质粒，将PSME3-Wt或PSME3-Mut与miR-NC，miR-504 mimics共转染进MCF-7细胞，检测各组细胞中的荧光素酶活性。
1.2.6 RT-qPCR检测mRNA表达：用Trizol试剂提取细胞、组织中的总RNA，并根据制造商推荐的方案， PSME3的mRNA表达水平以β-actin为内参，按照RT-qPCR试剂盒制造商指示，进行PCR反应。
1.2.7 Western blot检测PSME3蛋白表达：提取细胞或组织蛋白质，测定蛋白质浓度，加与12% SDS-PAGE分离蛋白质后进行转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。将1∶500比例稀释的PSME3抗体和1∶1 000稀释的β-actin抗体加入至PVDF膜，β-actin为内参，4 ℃孵育过夜。弃一抗，加入二抗，室温孵育1 h，随后进行ECL测定。
1.2.8 CCK-8法检测细胞增殖能力：转染24 h后，将3组MCF-7细胞接种于96孔板。随后每孔加入10 μL CCK-8溶液，黑暗中孵育2 h后，用酶标仪测定450 nm波长的吸光度(A)值。
1.2.9 流式细胞测量术检测细胞周期：将MCF-7细胞用0.01%胰蛋白酶消化30 min，再用预冷的PBS重悬并将细胞悬液加入预冷的70%乙醇中固定，置于4 ℃过夜。去除乙醇后用PBS洗涤2次并加入100 μL RNase A，37 ℃水浴30 min，接着添加400 μL PI染色并混匀，4 ℃避光30 min，最后用流式细胞仪检测细胞周期。
1.2.10 Transwell小室法检测细胞迁移能力：转染后，收集各组细胞，将细胞为2×105个/mL，然后将200 μL细胞悬液接种于上室，在下室加入600 μL含10%胎牛血清的培养基，随后恒温培养箱培养24 h。取出小室后，将小室置于95%乙醇中固定5 min；
在0.5%结晶紫染色液中染色10 min后，用PBS漂洗去除未结合细胞的染色液。用棉签轻拭去小室滤膜上层的细胞，在显微镜下观察滤膜下层细胞。
1.3 统计学分析
2.1 miR-504对乳腺癌裸鼠移植瘤生长的影响
miR-504过表达的裸鼠的瘤体体积和质量均明显低于对照组(图1A，B)，miR-504组裸鼠瘤体组织中Ki67阳性信号(绿色区域)较对照组明显降低，并且miR-504组裸鼠瘤体组织蛋白表达明显降低(图1C)。
2.2 PSME3是miR-504的靶基因
PSME3的3′-UTR上具有潜在的结合位点与miR-504形成互补(图 2A)。miR-504 mimics与pMIR-PSME3-Wt质粒共转染进MCF-7细胞时，荧光素酶活性明显降低；
在转染pMIR-PSME3-Mut细胞中荧光素酶活性均无明显变化(图2B)。MCF-7细胞转染miR-504 mimics组较NC组，PSME3的mRNA和蛋白表达均明显降低(P<0.01)(图2C，D)。
2.3 PSME3在乳腺癌组织中的表达
乳腺癌组织中PSME3的mRNA表达水平明显高于癌旁正常组织(图3A)。同时，乳腺癌组织中PSME3蛋白的表达也明显升高(P<0.01)(图3B)。
2.4 miR-504对MCF-7细胞增殖、周期和迁移的影响
miR-504 mimics组细胞的增殖能力较NC组明显降低， 但miR-504 mimics+PSME3组细胞的增殖的能力高于miR-504 mimic组(图4A)。miR-504 mimics组S期细胞比值降低，但miR-504 mimics+PSME3组，降低了miR-504mimics组对S期阻滞的抑制效果(图4B)。miR-504 mimics组能抑制细胞的迁移能力，但miR-504 mimics+PSME3组细胞的迁移能力明显高于miR-504 mimics组(P<0.01)(图 4C)。
A.TargetScan software prediction char; B.double luciferase reporter gene assay in MCF-7 cells; C.PSME3 mRNA expression was detected by RT-qPCR in MCF-7 cells; D.PSME3 protein expression was detected by Western blot in MCF-7 cells; *P<0.01 compared with NC group
A.RT-qPCR was used to detect PSME3 mNRA expression in breast cancer tissues; B.Western blot was used to detect PSME3 protein expression in breast cancer tissues; *P<0.01 compared with adjacent group
2.5 miR-504在乳腺癌裸鼠移植瘤模型中对PSME3表达的影响
miR-504组裸鼠瘤体组织中PSME3阳性信号(红色区域)的表达明显低于对照组(图5A)，同时miR-504组裸鼠组织中PSME3蛋白以及mRNA表达降低(图5B)。
A.cell proliferation was detected by CCK8 assay; B.S phase cell ratio was detected by flow cytometry; C.Transwell assay was used to detect the migration ability of cells; *P<0.01 compared with NC group; # P<0.01 compared with miR-504 mimics group
A.regulation of miR-504 on PSME3 was detected by immunofluorescence; B.regulation of miR-504 on PSME3 was detected by Western blot and RT-qPCR; *P<0.01 compared with NC group
MicroRNA表达特异性表达和恶性肿瘤的病理进程密切相关，研究发现在非小细胞肺癌中miR-504异常低表达，上调miR-504对非小细胞肺癌的细胞增殖、细胞侵袭和EMT过程有明显的抑制作用[7]；
miR-504在下咽鳞状细胞癌临床标本中表达下调，并通过靶向CDK6抑制下咽鳞状细胞癌细胞增殖[8]；
在视网膜母细胞瘤中，miR-504发挥抑癌作用[9]。MCF-7细胞是一种乳腺癌经典细胞系，该细胞具备分化的乳腺上皮细胞的一些特性，敲除一些基因可使MCF-7细胞株增殖能力减弱，其他一些基因的表达也能抑制其增殖[10]。在本研究中乳腺癌移植瘤裸鼠模型观察miR-504对瘤体生长的影响，发现miR-504高表达能抑制MCF-7细胞的增殖并导致瘤体的质量和体积均明显降低。这些结果提示miR-504可能参与了对乳腺癌细胞生物学行为的调节并对乳腺癌产生抑制效果。
通过与靶基因结合，miRNA可在转录后水平发挥生物学效应[11]。本研究通过预测并经过试验证实发现PSME3是miR-504的潜在靶基因，在MCF-7细胞中上调miR-504能抑制PSME3的mRNA和蛋白表达。另一方面，通过动物实验发现miR-504高表达的裸鼠瘤体组织中PSME3的表达明显降低，进一步证实了PSME3是miR-504的潜在靶点，因此推测PSME3是miR-504在乳腺癌中发挥作用的关键靶基因。
PSME3已证实在乳腺癌、甲状腺癌、结肠癌等多种肿瘤中异常高表达，发挥癌基因的功能[12-13]，比如在乳腺癌中，过表达PSME3可以诱导乳腺癌细胞EMT[14]。与既往研究结果类似，在本研究中，实验结果显示移植瘤裸鼠模型的乳腺癌组织中PSME3的mRNA和蛋白相对表达量均明显上升，提示PSME3与乳腺癌的发生发展密切相关。为了进一步确定miR-504对乳腺癌的影响，以及此过程PSME3作用中，通过细胞实验观察miR-504和PSME3对MCF-7细胞生物学行为的调节。实验结果表明，转染miR-504 mimics能抑制MCF-7细胞的增殖，S期阻滞和迁移能力，但PSME3高表达后，miR-504的调控效果被逆转。上述结果表明miR-504可能是通过负性调控PSME3的表达参与调节MCF-7细胞生物学行为从而发挥抑癌的作用。
综上，miR-504通过抑制PSME3抑制MCF-7细胞的增殖，S期阻滞和迁移能力，并且在裸鼠体内能抑制瘤体的生长，表明miR-504可能具有抑制乳腺癌的作用，并且在这一过程中PSME3作为靶基因发挥重要作用。
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