虾青素对D-半乳糖致衰老大鼠肾脏和心脏组织氧化损伤的修复作用

侯晓宁，张育昆，陈祉晴，肖杰，曹庸，刘晓娟

（华南农业大学食品学院，广东省功能食品活性物重点实验室，广东广州 510640）

衰老是机体自发正常的生理过程，常伴随着心脑血管疾病、恶性肿瘤、中风、阿尔茨海默症等疾病的发生[1]。氧化应激理论认为，当机体遭遇有害刺激时，体内活性氧（ROS）增多，过量的自由基攻击细胞膜、蛋白质和酶等生物大分子，产生大量代谢产物MDA，加剧衰老甚至死亡[2]。机体在对抗氧化应激损伤时，存在一定的抗氧化自我防御系统，包括内源性抗氧化酶（如SOD、CAT、GSH-Px）以及非酶性抗氧化物。肾脏是衰老相关组织损伤的典型靶器官。“肾元盛则寿延，肾元衰则寿夭”《医学正传》。人体衰老与否、衰老的速度以及寿命的长短，很大程度上取决于肾气的强弱。心脏是心血管系统的重要器官，发挥着泵功能的作用。心肌细胞内线粒体数量较多，线粒体不仅是ROS 介导细胞氧化损伤的主要靶点，也是ROS 产生的重要位点[3]，使得心脏更容易遭受氧化损伤。

D-半乳糖（D-galactose，D-gal）致大鼠衰老模型凭借其寿命缩短、学习记忆障碍和免疫力降低等多种自然衰老类似特征，广泛应用于抗衰老相关研究[4]。当机体积累过量的D-gal 时，D-gal 氧化酶会将其转化为醛糖和氢过氧化物，从而导致ROS 和糖基化终末产物（AGE）的产生[5]，严重损伤肾脏和心脏组织[6]。研究发现，雷帕霉素、二甲双胍和阿卡波糖等药物能有效延长实验动物的寿命[7]，目前已注册用于抗衰老的临床试验。然而服用过多药物会给机体带来副作用，研究逐步转向寻找一些天然抗氧化剂，如姜黄素、白藜芦醇、槲皮素、花青素等[8-10]。

虾青素是1938 年从龙虾中首次被分离出来的天然胞外抗氧化剂[11]，广泛存在于雨生红球藻、红法夫酵母和虾蟹外壳中。虾青素分子中的共轭双键链，以及共轭双键链末端的不饱和羟基和酮基具有比较活泼的电子效应，使它具有比其它他类胡萝卜素更高的抗氧化能力[12]。大量研究证实虾青素在抗炎、抗肿瘤、预防心血管疾病和神经保护等方面都有积极的促进作用[13-16]。基于D-gal 致衰老模型，El-Baz[17]、陈祉晴等[18]发现虾青素可以缓解实验大鼠肝脏的氧化应激状态，修复肝脏的免疫损伤。刘涵等[19]发现虾青素可以减轻大鼠的脑衰老。近年来研究表明，虾青素还可以改善糖尿病大鼠的氧化应激，缓解肾脏纤维化[20-22]；
减轻异丙肾上腺素、半胱氨酸、高脂饮食等诱导的心脏线粒体功能障碍，从而抑制氧化应激[22-25]。本实验从氧化应激的角度，研究虾青素对D-gal 致衰老大鼠肾脏和心脏组织氧化损伤的修复作用，为虾青素的开发利用提供科学依据。

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

雄性SD 大鼠，体质量120～140 g，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号：SYXK 2019-0135。

1.1.2 药品与试剂

全反式虾青素标准品（人工合成），纯度为97.00%±0.50%，由广东巨源生化有限公司生产。

总蛋白定量（BCA）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；
D-gal，美国Sigma-Aldrich 试剂公司；
MET，北京索莱宝生物技术有限公司；
羧甲基纤维素钠（CMC-Na），天津润圣纤维素科技有限公司；
无水乙醇、二甲基亚砜等其他化学品和试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器与设备

Enspire2300 多功能酶标仪，美国PerkinElmer 公司；
RM2235 石蜡切片机，德国Leica 公司；
CX41 光学显微镜，广州市明美光电技术有限公司；
JXFSTPR-32全自动样品快速研磨仪，上海净信实业发展有限公司；
5415R 高速冷冻离心机，德国Eppendorf 公司；
KQ-500B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；
WZ-100恒温水浴锅，上海申升科技有限公司；
旋涡混合仪，上海精科实业有限公司；
各种规格移液器，德国Eppendorf 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与饲养

48 只SD 雄性大鼠（120～140 g）适应性饲养7 d后,随机分为6 组：空白组（CK）、模型组（MOD）、阳性对照组（二甲双胍，MET）和虾青素低、中、高剂量组（AST-L、AST-M、AST-H），每组8 只，每笼4只。实验大鼠建模后用专用塑料鼠笼饲养，食用标准饲料，自由饮水，每日更换无菌碎木屑垫料，饲料和垫料由华南农业大学实验动物中心提供。鼠房光暗交替循环12 h，恒温（25±1）℃，相对湿度50%±10%。所有动物均按中国动物中心和华南农业大学动物委员会批准的方案进行治疗，所有动物程序均按照华南农业大学实验动物护理和使用指南进行，实验通过了中国动物中心动物伦理委员会和华南农业大学的批准。

1.2.2 模型建立与给药

将虾青素和二甲双胍均溶于含质量分数0.25%CMC-Na 的生理盐水中，以获得均匀悬浮液。空白组注射生理盐水，其余各组每日腹腔注射300 mg/kg（以体质量计，下同）的D-gal 生理盐水溶液。同时，实验组灌胃虾青素（低、中、高剂量各为5、10、15 mg/kg）或二甲双胍（300 mg/kg），空白组和模型组灌胃与实验组等容量的生理盐水（含0.25% CMC-Na）。连续9 周喂养大鼠，腹腔注射及灌胃给药的实际剂量根据大鼠体质量的变化实时调整。其中虾青素给药剂量参考依据：人类推荐的虾青素每日摄取量为4～50 mg，大鼠功能食品的剂量一般是人的5～30 倍。结合预实验结果，选择剂量分别为5、10、15 mg/kg 的虾青素用于本实验。

1.2.3 大鼠体质量及脏器指数的测定

实验期间，每日测量大鼠的体质量并观察记录其表观生理变化。末次给药后，先称重再麻醉处死大鼠。迅速解剖并取出肾脏及心脏组织，生理盐水洗去表面浮血，无菌滤纸吸干。称质量，按照下式计算脏器系数：

式中：

Z——脏器系数，%；

m1——脏器质量，g；

m——大鼠体质量，g。

1.2.4 抗氧化指标的测定

称取一定质量的肾脏和心脏组织，剪碎后在生理盐水中均质，制备10%（m/V）组织匀浆。低温间断研磨后，以4 ℃，3 600 r/min 离心10 min，吸取上清液用于后续实验。用市售试剂盒测定组织匀浆中的蛋白浓度，MDA 含量以及SOD、CAT 和GSH-Px 活性。所有指标的测定均严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.5 组织病理学检查

将肾脏和心脏组织置于质量分数4%多聚甲醛中，固定24 h 后用无水乙醇脱水。再将组织包埋于石蜡中，切片机切割至5 μm 厚。苏木精-伊红（HE）染色后，依次观察肾脏和心脏组织在40×、100×、200×、400×光学显微镜下的形态，以评估病理学变化。

1.2.6 数据统计处理

采用SPSS 17.0 软件进行统计分析，测定数据以平均值±标准差表示。采用单因素方差分析并LSD 法进行多重比较，结果在p＜0.05 时被认为具有统计学意义。采用Origin 8.0 软件作图。

2.1 虾青素对大鼠表观及脏器系数的影响

实验期间，大鼠正常生长和摄食。随着灌胃时间的延长，各组大鼠体质量均有所上升。和CK 组相比，MOD 组大鼠表现出明显的衰老相关体征，如皮毛暗淡粗糙、脱毛增多、行动迟缓等。和模型组相比，虾青素组大鼠的生活状态相对活跃，行动敏捷，性情温和，毛发呈淡黄色。AST-H 组和MET 组大鼠有趋于CK 组的表现。初步判断虾青素可以增强D-gal 衰老模型大鼠的行为活动，延缓表观生理变化。

脏器系数可以一定程度反映机体的衰老程度[26]，脏器系数增大表示脏器充血、水肿或增生肥大，脏器系数减小常表示脏器出现萎缩及其它退行性改变。由表1可知，各组大鼠的体质量之间无显著性差异（p＞0.05），说明虾青素不会干扰实验大鼠的生长状况。与CK 组相比，MOD 组大鼠肾脏及心脏系数均显著降低（p＜0.05），表征肾脏和心脏组织的肥厚程度有所影响，出现了不同程度的萎缩现象，可能与遭受D-gal 带来的氧化损伤有关。和MOD 组相比，虾青素组大鼠肾脏和心脏系数均有所提高，AST-M 组和AST-H 组改善明显（p＜0.05）。说明虾青素能缓解D-gal 导致的肾脏和心脏组织的氧化损伤，对大鼠的衰老有延缓作用。

表1 虾青素对衰老大鼠脏器系数的影响Table 1 Effects of astaxanthin on organ indexes in rats (n=8)

2.2 虾青素对衰老模型大鼠肾脏和心脏组织中MDA 含量的影响

MDA 含量的高低可以反映机体脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤的程度[27]。如图1 所示，MOD组大鼠肾脏和心脏组织中的MDA 含量均显著高于空白组（p＜0.01），分别增加了57.30%、65.74%。由此推测，D-gal导致衰老大鼠体内的脂质过氧化产物增加，衰老模型构建成功。虾青素作用后大鼠肾脏和心脏组织中的MDA 含量显著降低，其中高剂量组分别减少了29.52%、38.02%（p＜0.01），和MET 组之间无明显差异（p＞0.05）。推测虾青素可以有效抑制衰老大鼠体内的脂质过氧化，保护生物膜免受氧化损伤，从而延缓衰老。

图1 不同处理下衰老大鼠肾脏（a）和心脏（b）组织中MDA 含量Fig.1 MDA content in kidney (a) and heart (b) tissues of aged rats under different treatments

2.3 虾青素对衰老模型大鼠肾脏和心脏组织中CAT 活力的影响

CAT 是过氧化物酶体的标志酶,约占过氧化物酶体酶总量的40%。它存在于动物的各个组织中，通过催化H2O2分解为H2O 与O2，使机体免受有害物质的损伤[28]。图2 显示，和CK 组相比，模型组大鼠肾脏和心脏组织中的CAT 活力显著降低（p＜0.01）。随着虾青素浓度的增加，大鼠肾脏和心脏组织中的CAT 活力逐渐上升，呈现一定的剂量依赖效应。其中AST-H 组的CAT 活力较模型组显著增加了43.73%、52.08%，差异具有统计学显著性（p＜0.01）。和MET 组之间无显著性差异（p＞0.05）。虾青素能提高机体清除H2O2的能力，从而减轻氧化损伤，达到延缓衰老的功效。

图2 不同处理下衰老大鼠肾脏（a）和心脏（b）组织中CAT 活力Fig.2 CAT activity in kidney and heart of aged rats under different treatments

2.4 虾青素对衰老模型大鼠肾脏和心脏组织中SOD 活力的影响

SOD 存在于绝大多数生物细胞中，它能催化超氧化物发生歧化反应转化为O2和H2O2，其活性大小可以反映机体清除自由基能力[29]。如图3 所示，和CK 组相比，模型组大鼠肾脏和心脏组织中的SOD 活力明显降低（p＜0.01）。和MOD 组相比，虾青素和MET 作用后各组大鼠肾脏和心脏组织中的SOD 活力显著增加，其中肾脏组织中虾青素各组呈现出一定的剂量依赖效应，心脏组织中AST-L 和AST-M 组较为相近。AST-H作用下大鼠肾脏和心脏组织中的SOD 活力最强（p＜0.01），分别提高了37.22%、85.47%，且高于MET 组（p＞0.05）。由此判断虾青素可能通过减少体内自由基的积累，从而抵御氧化应激。

图3 不同处理下衰老大鼠肾脏（a）和心脏（b）组织中SOD 活力Fig.3 SOD activity in kidney and heart of aged rats under different treatments

2.5 虾青素对衰老模型大鼠肾脏和心脏组织中GSH-Px 活力的影响

GSH-Px 是体内重要的自由基捕获酶之一，它通过特异催化还原性GSH 与H2O2反应，生成对机体无毒害的水和氧化型GSH，从而保护细胞膜结构和功能的完整[30]。如图4 所示，和CK 组相比，MOD 组大鼠肾脏和心脏组织中的GSH-Px 活力显著下降（p＜0.01）。MET 和虾青素各组大鼠肾脏和心脏组织中的GSH-Px活力较MOD 组显著提高。其中虾青素对肾脏组织中GSH-Px 活力的作用强于心脏组织，均表现出极显著差异（p＜0.01）。肾脏组织中，AST-M 组大鼠GSH-Px活力改善最为明显，较MOD 组提高了63.01%，和MET组之间无显著性差异（p＞0.05）。心脏组织中，随着虾青素浓度的增加，GSH-Px 活力不断提高，AST-H 组显著提高了64.77%（p＜0.01）。以上结果说明虾青素可能通过消灭自由基，减轻细胞膜的氧化损伤，从而增强机体的抗氧化防御机制。

图4 不同处理下衰老大鼠肾脏（a）和心脏（b）组织中GSH-Px 活力Fig.4 GSH-Px activity in kidney of aged rats under different treatments

2.6 虾青素对D-半乳糖致衰老大鼠肾脏和心脏组织形态学的影响

随着年龄的增长，肾脏的宏观和微观结构均会发生变化。在宏观结构水平上，肾皮质体积减小，肾脏总体积也会逐渐收缩；
在微观结构水平上，肾脏的衰老主要表现在肾间质纤维化、肾小球硬化、肾小管萎缩和肾小囊囊腔扩充等方面。图5 可以观察到CK 组大鼠肾脏组织中的肾小球分布密集,数量正常，呈圆形或椭圆形,外周规整,血管球内毛细血管襟密集,肾小囊的囊腔狭小。肾小管的管腔大多为规整、狭小。而MOD组大鼠肾小球分布稀疏,直径明显增大,数量减少，肾小囊囊腔显著增宽,血管球不规则而松散,体积缩小,缩向血管极一侧,并可见散在的空泡样肾小球。虾青素处理后，肾脏组织的形态较模型组有所改善。随着虾青素浓度的增加，肾小球直径逐渐减小，肾小囊囊腔变窄，血管球分布趋于正常。MET 组肾小球少量血管球缩向血管极一侧，直径接近AST-M 组，肾小囊囊腔接近AST-H。说明虾青素能一定程度缓解D-半乳糖带来的肾脏组织的氧化损伤。

图5 虾青素对衰老大鼠肾组织形态学的影响（HE 染色，×400）Fig.5 Effect of astaxanthin on renal histomorphology in aged rats (HE staining,×400)

心脏衰老常伴随着宏观上的心脏萎缩（心脏体积减小、重量减轻、呈深褐色）、心肌肥大（心室壁及室间隔增厚、心室腔减小）及纤维素性心包炎，以及微观上心肌细胞的坏死、心肌组织纤维化。图6 可以观察到CK 组心肌组织胞浆丰富呈粉红色，横纹结构隐约可见；
心肌细胞饱满，排列整齐，胞膜完整，核清晰可见，无病理改变。然而经D-gal 处理后，MOD 组心肌纤维淡染，间质水肿明显，间隙增大,细胞排列紊乱，部分心肌细胞坏死，较多空泡。虾青素作用后仍有部分心肌细胞出现空泡现象，但较MOD 组有明显改善。随着虾青素浓度的增加，心肌纤维排列趋于规整，细胞间质减少且间隙减小，细胞排列整齐。MET 组较MOD 组有明显改善，病理形态介于AST-L 和AST-M组之间。说明虾青素对D-gal 带来的心脏组织的氧化损伤有一定的修复作用。

图6 虾青素对衰老大鼠心组织形态学的影响（HE 染色，×400）Fig.6 Effect of astaxanthin on renal histomorphology in aged rats (HE staining,×400)

D-半乳糖是一种还原性己醛糖，通常存在于人体、牛奶、甜菜、某些树胶和植物黏液中。半乳糖是肠道内吸收最快的单糖，可在摄入后8 h 内由机体代谢并排出体外[31]。然而摄入过多D-半乳糖会使机体产生大量ROS，从而诱导氧化应激，并引起记忆障碍、神经炎症和神经退行性改变等疾病的发生[32]。D-半乳糖致衰老模型以氧化应激理论为基础，诱导机体老化，且在整个过程中副作用最小、存活率较高，是目前公认的衰老动物造模方法。本研究连续9 周给大鼠腹腔注射D-半乳糖（300 mg/kg），和空白组相比，模型组大鼠表现出明显的衰老相关特征，肾脏系数和心脏系数显著下降，肾脏和心脏组织中MDA 含量显著升高，抗氧化酶（SOD、CAT 和GSH-Px）活力均有不同程度的降低，且肾脏和心脏组织都显示出明显的氧化损伤，衰老大鼠模型构建成功。

本实验结果表明虾青素各剂量组能不同程度地改善衰老大鼠的表观生理变化，恢复肾脏系数和心脏系数，其中高剂量组效果最为明显。说明虾青素能有效增强衰老大鼠的体质，减缓肾脏和心脏组织萎缩现象的发生。陈宏运等[33]连续30 d 给小鼠皮下注射D-半乳糖（100 mg/kg），模型组小鼠的脾脏指数和胸腺指数均有所下降，可能与衰老过程常伴随免疫器官的萎缩、免疫功能的下降有关；
牛佳玮等[34]给小鼠注射120 mg/kg 的D-半乳糖，连续造模4 周后，模型组小鼠肝脏系数和肾脏系数显著减小，推测是由氧化损伤带来的机体代谢能力下降所造成的。这些研究虽与本实验在D-半乳糖浓度和造模时间的选择上略有异同，但也表现出类似的衰老趋势。注射D-半乳糖会导致实验动物各脏器出现不同程度的萎缩，极大干扰脏器的正常功能，破坏机体稳态，从而加速衰老进程。

进一步地，组织切片结果不但能直观反映出病变组织的物理损伤情况，还可以间接评估机体的衰老程度。组织形态学观察发现，肾脏纤维化与炎症反应有关，肾小管硬化与自由基攻击蛋白质相关，肾小球皱缩减少说明存在衰老现象[35]。本研究中模型组大鼠肾脏组织表现出肾间质纤维化、肾小囊囊腔增宽、肾小球明显皱缩、数量减少且排列紊乱，虾青素作用后各组大鼠肾脏组织的氧化损伤有所修复，肾小囊囊腔变窄，血管球分布趋于正常。说明虾青素可能通过抵御自由基攻击、清灭或局限致炎因子，从而保护肾脏组织免受氧化损伤。研究表明D-半乳糖可通过增加氧化应激、降低抗氧化剂水平损伤心脏形态，从而诱导心脏衰老。本实验中，模型组大鼠心脏组织中心肌细胞淡染，细胞间质水肿增大，以及部分心肌细胞坏死。而经虾青素作用后，衰老大鼠心脏组织的氧化损伤有所修复，心肌细胞胞浆丰富，心肌纤维排列趋于规整。可能是虾青素抑制D-gal 诱导的氧化应激反应，减少了ROS 积累量，从而缓解了心脏组织的氧化损伤。

抗氧化酶系统是机体抵抗自由基的重要防御体系，多种抗氧化酶相互作用所构成的网络能保护细胞免受氧化损害，提高抗氧化水平。SOD、CAT 和GSH-Px是主要的内源性抗氧化酶，常被用作衡量机体抗氧化能力的重要指标。其中，SOD 将超氧阴离子自由基（）歧化为O2和H2O2，CAT 和GSH-Px 进一步催化H2O2变为H2O，从而阻止机体中羟基自由基的产生，达到抗氧化效果。此外，自由基作用于脂质产生氧化终产物MDA，同时MDA 还可与DNA、蛋白质交联，与细胞膜上的磷脂产生化学作用，从而进一步损害细胞[36]。因此，MDA 含量的高低不但可判断脂质过氧化程度，还可用来评价机体衰老程度[37]。MDA 含量越高，说明生成的氧自由基越多，氧化反应越激烈，组织的氧化损伤也越严重。本研究中，15 mg/kg 虾青素作用后，衰老大鼠肾脏和心脏中MDA 含量分别减少了29.52%、38.02%。SOD、CAT 和GSH-Px 活力均显著提升，并表现出随着虾青素剂量增加而效果逐渐明显的趋势。说明虾青素能增强衰老大鼠的抗氧化能力，且存在一定的剂量依赖效应。Chen 等[18]发现15 mg/kg虾青素能使衰老大鼠脑、肝脏和血清中MDA 含量分别减少34.82%、95.74%和41.32%。此外，虾青素还显著提高了衰老大鼠脑、肝脏、血清中的抗氧化酶活力[19]。据报道，藏红花素可以保护D-半乳糖诱导的肝脏损伤，抑制衰老大鼠体内MDA、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP）水平[38]；
杜氏盐藻能改善D-半乳糖造成的心脏功能障碍，提高衰老大鼠心脏中SOD、CAT 活力，降低MDA、TNF-α 和IL-6 水平[39]；
Zhang[40]发现红酵母红素不但能提高衰老小鼠体内的SOD、CAT 和GSH-Px 活力，还降低了炎症因子水平，显著改善了由D-半乳糖诱导的记忆功能障碍、氧化应激和神经炎症。

本实验基于D-半乳糖诱导的衰老大鼠模型，研究虾青素对衰老大鼠肾脏和心脏组织的保护作用。结果表明，虾青素可以通过降低脂质过氧化物的产生，提高抗氧化酶活力和修复肾脏和心脏组织的氧化损伤来延缓衰老。其机制可能与减少肾脏和心脏自由基损伤有关，具体作用机制有待进一步研究。

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