诃子汤炮制草乌血中移行成分差异研究
时间：2023-06-07 16:05:10 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
策力木格，许 良，松 林，图 雅
(内蒙古民族大学1.蒙医药学院、2. 化学与材料学院，内蒙古 通辽 028000；
3.内蒙古医科大学蒙医药学院，内蒙古 呼和浩特 010110；
4.中国中医科学院中医药研发中心，北京 100700)
草乌为毛茛科乌头属植物北乌头(AconitumkusnezoffiiReichb.)的干燥块根，是中医、蒙医常用药，其毒性极大，因此临床用药都先经过炮制。蒙医认为诃子可解草乌毒。多年以来，蒙医大夫应用草乌多与大剂量诃子配伍使用，或以药对形式配伍入煎剂，或以诃子汤炮制品入丸散剂以达到调和药性、降低毒性，更好地发挥疗效[1-2]。多年经验证实此方法的可行性，同时，近年来响应国家注重天然药物的发展趋势，诃子汤炮制草乌蒙医特色炮制方法收到了广泛的关注。但是，目前，国内外有关诃子解草乌毒的研究主要从毒性评价、化学物质基础等方面阐明配伍减毒增效的机制，而从药物吸收代谢入血成分(即特征性有效成分)的角度阐述诃子解草乌毒的相关报道研究较少[3-6]。对此，本研究基于血清药物化学方法，运用高效液相色谱串联质谱技术检测灌胃给药大鼠血浆中生草乌及诃子汤炮制草乌入血成分，以此探讨诃子汤炮制草乌机制。为今后进一步深入研究诃子汤炮制草乌的机制、代谢规律以及临床安全合理用药提供实验依据。
1 材料
1.1 仪器与设备UPLC I-CLASS超高效液相色谱仪；
G2-SQTof质谱仪；
Waters ACQUITY uplc-i-class系统数；
十万分之一电子天平(MettlerToledo公司，美国)；
移液枪(Rainin Instrument公司，美国，10 μL，100 μL、200 μL、1 000 μL)；
超声波清洗器(上海必能信超声有限公司)；
旋转蒸发仪(上海，亚荣生化仪器厂)；
低温冰箱(三洋公司，日本)。
1.2 药品与试剂草乌(湖北聚瑞中药饮片有限公司，批号：141001)经内蒙古医科大学蒙医药学院松林教授鉴定为毛茛科植物北乌头(AconitumcarmichaeliDebeaux)的干燥块根；
对照品：乌头碱(批号：MUST-15013008)、次乌头碱(批号：MUST-15090918)、新乌头碱(批号：MUST-15091504)、苯甲酰乌头原碱(MUST-15012215)、苯甲酰次乌头原碱(MUST-150108006)、苯甲酰新乌头原碱(MUST-16012816)、塔拉萨敏(MUST-14111811)、次乌头原碱(MUST-14123010)、滇乌头碱(MUST-14110715)、草乌甲素(MUST-14100913)、硬飞燕草碱(MUST-14102105)、乌头原碱(MUST-14121101)、新乌头原碱(MUST-16030604)、高乌甲素(MUST-15030509)、宋果灵(MUST-16032515)、附子灵(MUST-15060810)、尼奥林(MUST-14052513)、多根乌头碱(MUST-15031213)、德尔塔林(MUST-14091408)；
乙腈(HPLC-MS级，Fisher Scientific公司)，氨水(色谱纯，FluKa公司)，醋酸铵(色谱纯，DikmaPure公司)，乙醚(分析纯，国药集团化学试剂公司)，超纯水(自制)。诃子(仁和中药有限公司，批号：20140101)经内蒙古医科大学蒙医药学院松林教授鉴定为使君子科植物诃子TerminaliachebulaRetz.的干燥成熟果实。甲醇(HPLC-MS级，Fisher Scientific公司)；
冰醋酸(四平巨能药业有限公司)；
乙醇(天津市风船化学试剂厂)；
实验用水为自制去离子水。磷酸二氢钠(Japan.Batch，093k0096)、氯化镁(天津市福晨化学试剂厂，20151220)、生理盐水、肝素钠(天津生物化学制药有限公司)、水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)。
1.3 实验动物清洁级SD大鼠，♂，体质量(200±20)g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，生产许可合格证号SYXK(京)2017-0033。饲养于室温22～24 ℃，相对湿度60%。实验前适应性喂养7 d，自由饮水和进食。
2 方法
2.1 分组取SD大鼠24只，随机分为空白组、生草乌组、诃子汤炮制草乌组，每组8只。所有大鼠实验前禁食12 h，自由饮水。
2.2 诃子汤炮制草乌的制备取生草乌药材量1/2 的诃子加10倍量水煎煮1 h，4层纱布过滤，用滤液浸泡生草乌2 d再煎煮8 h，捞出草乌置于方盘中60 ℃烘干。
2.3 药物制备称取生草乌、诃子汤炮制草乌干燥粉末适量，加适量0.5%羧甲基纤维素钠，混匀，配制成浓度为0.16 kg·L-1的生草乌、炮制制草乌混悬液(大鼠给药计量为1.6 g·kg-1)。
2.4 给药及血清样本采集给药组大鼠称体质量后1 mL·100 g-1的剂量灌胃给药，空白组灌胃给羧甲基纤维素钠，分别与给药后15、30、45 min、1、1.5、2、4、8、12、24 h眼眦采血0.5 mL，放入肝素化的EP管中静置40 min后，4 ℃、4 000 r·min-1离心10 min，取上清液，合并同一采血时间点的不同大鼠的血浆，作为各时间点含药血浆，备用。
2.5 含药血浆的检测
2.5.1血浆样品的处理 将“2.4”项下制备所得血浆生草乌组10个时间点各取200 μL混合作为生草乌含药血浆，诃子汤炮制草乌组10个时间点各取200 μL混合作为诃子汤炮制草乌含药血浆。
取200 μL血浆加40 μL氨水混悬1 min，再加入1 mL乙醚混悬5 min，10 000 r·min-1离心10 min，取上清，氮气吹干，40 μL 70%乙腈复溶，进样检测。
2.5.2混合对照品样品的制备 分别取乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、塔拉萨敏、次乌头原碱、滇乌头碱、草乌甲素、硬飞燕草碱、乌头原碱、新乌头原碱、高乌甲素、宋果灵、附子灵、尼奥林、多根乌头碱、德尔塔林；
对照品适量，精密称定，置于10 mL量瓶中，加入空白血浆超声溶解并定容，取200 μL加氨水混悬1 min，再加入乙醚混悬5 min，10 000 r·min-1离心10 min，取上清，氮气吹干，70%乙腈复溶，制得质量浓度为1.000 g·L-1的混合对照品溶液备用。
2.5.3分析条件 色谱条件：色谱柱：ZOX Extend-C182.1×100 mm 1.8 μm；
柱温：40 ℃；
进样量：0.1 μL；
水相A：10 mmol醋酸铵水溶液(氨水调pH=9.02)，有机相B：乙腈洗脱时间梯度见Tab 1。
Tab 1 Elution time gradient
质谱条件：毛细管电压：0.5 kV；
锥孔采样电压：40 V；
去溶剂气温度：450 ℃；
去溶剂气流量：900(L·h-1)；
锥形气体流量：50(L·h-1)；
离子源温度：100 ℃；
碰撞能量：使用自动碰撞能量(电子伏特)6；
质量精度保持使用锁定喷雾与亮氨酸脑啡肽浓度在200 g·L-1和流量10 μL·min-1作为参考[m/z556.276 6 ESI(+)和554.262 0 -(-)]；
扫描方式为正离子扫描，质量扫描范围50～1 200。
3 结果
3.1 实验结果在上述提取方法及检测条件下，样品及对照品检测结果如Fig 1。
由图可知，血中移行成分在含药血浆中浓度较低，容易被大量的血浆内源性成分色谱峰所掩盖，很难在全扫描模式下被直观地检测出，故需采用提取离子流图对草乌血中移行成分进行逐一比对分析。
3.2 血中移行成分的分析表征利用MasslynxV4.1工作站中的“strip”工具，设定空白血浆样品图谱作为基线背景，输入含药血浆图谱进行处理去除血浆中内源性成分，得到含药血浆减去空白血浆的色谱图后再进一步地手动排查确认，从而筛选出空白血浆中没有、含药血浆中有的色谱峰，推测草乌血中移行成分。将确定的血中移行成分的保留时间、精确分子质量、碎片离子等信息与对照品、本研究前期工作草乌药材化学成分鉴定结果、查阅文献报道[6-14]以及Massbank数据库，分析质谱裂解规律，在大鼠口服生草乌后含药血浆样品中检测到11个血中移行成分，共鉴定出其中6个原型成分和5个未知成分见Tab 2，大鼠口服诃子汤炮制草乌后含药血浆样品中检测到14个血中移行成分，共鉴定出其中8个原型成分和6个未知成分，见Tab 3。
Fig 1 LC-MS spectrum of plasma detection
3.3 原型成分的鉴定示例以化合物次乌头碱(保留时间为17.91)为例，与空白血浆相比，大鼠给药后含药血浆中检测到准分子离子峰m/z616.314 0[M+H]+，在高碰撞能条件下将m/z616.314 0进一步打碎，得到碎片离子主要有m/z584.280 3；
m/z556.285 7；
m/z524.264 6；
m/z496.269 9；
m/z492.238 5；
m/z338.174 3与对照品检测图谱中及草乌药材化学成分图谱中化合物次乌头碱的保留时间及碎片离子一致，如Fig 2，因此推断该化合物为次乌头碱。
4 结论
本实验在系统全面地建立大鼠口服草乌后血中移行成分分析方法的基础上，应用Masslynx V4.1质谱工作站，通过与空白血清与对照品对比，生草乌后含药血浆样品中检测到11个血中移行成分，共鉴定出其中6个原型成分和5个未知成分，大鼠口服诃子汤炮制草乌后，含药血浆样品中检测到14个血中移行成分，共鉴定出其中8个原型成分和6个未知成分。此外，对比血中移行成分鉴定结果发现生草乌与诃子汤炮制草乌入血相同成分有9个，其中5种成分已鉴定出，分别为苯甲酰新乌头原碱、尼奥林、新乌头原碱、次乌头原碱、乌头碱，生草乌入血但诃子汤制草乌没有成分有2个，已鉴定出其中一种为新乌头原碱。诃子汤炮制草乌入血生草乌没有的成分有5个，鉴定出其中3分别为苯甲酰次乌头原碱、北乌碱A、10-羟基乌头碱。由于，入血成分才有可能是药效成分，因此以后诃子汤炮制草乌机理研究的重点可着重选择几个入血成分。此外，应该重视草乌及其炮制品入血成分的差异成分，这些成分也有可能是诃子汤炮制草乌解毒机制的关键所在。
Tab 2 Identification of blood transitional components in raw Radix Aconiti kusnezoffii group
Tab 3 Identification of transitional components in prepared Radix Aconiti kusnezoffii blood
Fig 2 Fagment ion diagram of aconitine
5 讨论
血清药物化学的研究[15-17]目的是对含药血清中外源性成分及其作用和代谢规律进行鉴定和表征，从而为快速、准确地阐明单药及复方的药效物质基础和作用机制提供理论依据。
草乌毒性大，且体内吸收代谢过程复杂，因此给药剂量大容易毒死实验动物，给药剂量小又不易检测其血浆中移行成分，因此为了能够更清晰、全面的检出草乌血中移行成分，本实验前期工作对实验动物给药剂量进行了优化实验，采用了本次实验用草乌极限给药剂量，即保证实验动物不被毒死的情况下的最大给药剂量。生草乌、诃子汤炮制草乌最大耐受量分别为1.6 g·kg-1、2.18 g·kg-1。
此外，由于生物样品尤其是血液中含有大量的酶和蛋白，这些内源性物质的存在，可继续降解血中药物成分，降低待测成分的血药浓度，干扰待测成分的检测，同时对用于检测的仪器设备亦有损伤。因此，本实验在对血浆样品分析检测前需要进行除蛋白等前处理工作进行了优化，分别对甲醇沉淀法、乙腈沉淀法和固相萃取法及液液萃取(乙醚萃取)法进行了考察。结果与甲醇、乙腈沉淀蛋白法固相萃取法相比，乙醚萃取法制备的血浆样品，可检测到的入血成分较多，以20 μg·L-1的混合标准品为标准，计算得相对峰面积可看出乙醚萃取成分含量高，同时，其得到的图谱中色谱峰的分离效果好、离子强度高、空白干扰小，因此，选用乙醚萃取法作为血浆处理方法。此研究建立了生草乌、诃子汤炮制草乌有效成分血浆中检测方法，得出不同时间点生草乌、诃子汤炮制草乌血药浓度，给后续药代、毒代动力学研究提供了依据。
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