猴痘病毒及其疫苗的研究进展
时间：2023-06-02 09:00:27 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
吕诗韵，卢佳，李新国，杨晓明
1.武汉生物制品研究所有限责任公司，湖北 武汉 430207；
2.中国生物技术股份有限公司，北京 100029
猴痘病毒（monkeypox virus，MPXV）属痘病毒科（Poxviridae）、脊痘病毒亚科（Chordopoxvirinae）、正痘病毒属（Orthopoxvirus）的猴痘病毒种。正痘病毒属还包括天花病毒（variola virus，VARV）、牛痘病毒（cowpox virus，CPXV）和痘苗病毒（vaccinia virus，VACV）［1］。猴痘是由MPXV 感染导致的人畜共患疾病，临床症状与天花相似，症状较轻。自1977年全球根除天花以来，MPXV 成为威胁人类生命健康的重大隐患之一［2］。2022年5月以来，多个非猴痘流行国家相继报告了猴痘确诊病例，引起了全球的广泛关注［3］。截止2022年11月，已有超过100 个国家和地区报告了猴痘病例，累计确诊超过7.7 万例，绝大多数发生在今年以前从未报告猴痘病例的地区，累计死亡病例38 例，其中美国报告的猴痘病例超过2.7 万例，位居全球之首，给全球公共卫生安全带来巨大威胁。中国重庆、中国香港、中国台湾共出现3 例输入性猴痘病例。为避免MPXV 传入国内，需增强对MPXV 的认识，提高警惕性，采取各种积极有效的防控措施。同时还应加速研制安全有效的猴痘疫苗及抗病毒药物，为猴痘疫情的防控提供切实的保障。本文对MPXV 及其疫苗的研究进展作一综述，以期进一步了解MPXV 及其疫苗研制策略，为防控猴痘疫情在全球的传播提供帮助。
1.1 MPXV流行病学 MPXV起源于非洲热带雨林，1958年，首次从丹麦哥本哈根国家血清研究所受感染食蟹猴的囊泡-脓疱病变中分离得到［4］。1970 —1979年期间，共发现了47 例人类猴痘病例，其中38例发生在刚果，其余发生在喀麦隆、中非共和国、加蓬、科特迪瓦、利比里亚、尼日利亚和塞拉利昂［5］。1981—1986年期间，非洲报告了404例人猴痘病例，其中有386例（96%）来自刚果民主共和国。此后，猴痘作为非洲地区特有的一种人畜共患疾病在小范围内传播，主要集中在刚果。2003年夏天，美国中西部地区报告了72 例猴痘病例，这是西半球首次出现MPXV［6］。2017年，在尼日利亚暴发了较大规模的猴痘疫情，共发现262例疑似病例、115例确诊病例和7例死亡病例［7］。2022年5月以来，多个非猴痘流行国家报告了猴痘确诊病例，证实了猴痘疫情逐渐在世界范围内蔓延。2022年7月23日，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）宣布猴痘疫情构成“国际关注的突发公共卫生事件（Public Health Emergency of International Concern，PHEIC）”。此次猴痘疫情病例数量增长迅速，扩散范围极广，在猴痘疫情发展历史上前所未有。
人群对MPXV 普遍易感，既往接种天花疫苗者对MPXV 存在一定程度的交叉保护。所有年龄的人群均可能感染MPXV，幼儿和免疫功能低下人群的病死率较高，尤其是未预防接种天花疫苗的儿童一旦感染，病死率可达11%。猴痘为自限性疾病，大部分预后良好。严重病例常见于年幼儿童、免疫功能低下人群，预后与感染的不同病毒株、病毒暴露程度、既往健康状况和并发症严重程度等有关。接种天花疫苗在过去具有保护作用，消灭天花后，全球范围内停止了天花疫苗接种，因此，40岁以下人群可能更易感染MPXV。MPXV 经黏膜和破损皮肤侵入人体，主要通过接触感染动物的呼吸道分泌物、病变渗出物、血液、其他体液，或被感染动物咬伤、抓伤而感染［8］。人与人之间主要通过密切接触传播。
1.2 MPXV 生物学特性 MPXV 是正痘病毒属（痘病毒科，脊痘病毒亚科）的一员，该群体的其他成员包括VARV（天花的病原体）和CPXV 等［1］。正痘病毒均含有可溶性抗原、核蛋白抗原和红细胞凝集素，抗原性质基本相同，彼此之间有交叉免疫原性。正痘病毒是包膜砖状病毒，含有大小约200 000 bp 的双链DNA 基因组，正痘病毒在抗原方面彼此密切相关，且在基因组水平上显示出显著的同源性。与其他DNA 病毒不同，正痘病毒在宿主细胞细胞质中复制，其组装涉及脂蛋白双层外膜的获取和脱落。在该复杂过程中，产生4 种不同形式的病毒粒子：细胞内成熟病毒（intracellular mature virus，IMV）、细胞内包膜病毒（intracellular enveloped virus，IEV）、细胞相关包膜病毒（cell-associated enveloped virus，CEV）和细胞外包膜病毒（extracellular enveloped virus，EEV）。细胞内和细胞外病毒在发病机制中均起重要作用。IMV 和IEV 参与病毒在细胞之间的传播，从而使细胞释放的病毒能在受感染的生物体内传播。
MPXV 是一种有包膜的双链DNA 病毒，基因组相对较大，约为197 000 bp，编码190 个开放阅读框（open reading frame，ORF），构成病毒在细胞质中复制所需的大部分材料，与正痘病毒属的典型基因组结构一样，位于MPXV 的中央编码区（central coding region sequence，CRS）高度保守，其两侧是包含反向末端重复（inverted terminal repeats，ITR）的可变末端［9］。ITR主要由发夹结构、串联重复和一些ORF组成。虽然MPXV 是一种DNA 病毒，但其病毒DNA 复制、转录、病毒粒子组装和释放所需的所有蛋白质的编码均依赖于宿主细胞，并在宿主细胞的细胞质中发生。电镜下MPXV 颗粒呈砖形或椭圆形，大小为200 nm × 250 nm，有包膜。病毒颗粒中有结构蛋白和DNA 依赖的RNA 多聚酶，双链DNA 核蛋白组成类哑铃状核心，外周被脂蛋白双层外膜所包裹。
MPXV 根据血凝素、TNFR 基因的限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphisms，RFLP）和基因测序分析确定了两个主要分支：西非（WA）株和刚果盆地（CB）株。这两个分支具有明显的地域划分、流行病学和临床差异，西非分支猴痘患者的病死率约为3.6%，刚果盆地分支猴痘患者病死率可达10.6%。WA分离株主要来自尼日利亚、利比里亚、科特迪瓦、塞拉利昂和美国，而CB 分离株主要来自加蓬、喀麦隆、刚果和苏丹。2022年第1 批猴痘病例的基因组序列显示，从系统发育上看，这些病毒是2017— 2019年从新加坡、以色列、尼日利亚和英国诊断的病例中采样的一个支系的后代。将来自葡萄牙、比利时、美国、澳大利亚和德国的2022年基因组与最接近的早期基因组进行比较，确定了47 个单核苷酸差异［10］。由于MPXV 被认为是一种人畜共患病毒，人与人之间的传播有限，该分支的出现可能是MPXV 对人类适应性的证据，增强了病毒的传播能力，同时也增加了研发高效猴痘疫苗的难度。
1.3 MPXV 蛋白 MPXV 粒子中含有蛋白和DNA 依赖的RNA 多聚酶［11］。MPXV 基因组划分为A ～P 16个区段，编码200 多种蛋白，目前的研究主要集中在一些具有免疫原性的蛋白。如具有保护免疫原性的成熟病毒粒子表面蛋白L1、A27、D8、H3 和囊膜病毒粒子的表面蛋白B5 和A33［12］。A 区的A29L基因编码的A29L 蛋白是存在于IMV 粒子表面的囊膜蛋白，是MPXV 的单抗靶点［13］。A29L 蛋白介导识别宿主细胞，使病毒与宿主细胞催化融合。A35R 是囊膜病毒粒子的重要成分，在病毒传播中发挥重要作用，是疫苗研发的重要靶点，也是血清学检测的潜在靶点［14］。A6R 是病毒复制的必要蛋白，为RNA 聚合酶前体（约22 kD）。E8L 是囊膜病毒粒子蛋白，在病毒入侵宿主细胞过程中发挥关键作用，A6R 和E8L 是潜在的药物靶点［14］。H3L 蛋白位于病毒粒子的囊膜，是一种糖基转移酶［15］。MPXV 具有正痘病毒的典型特征，在复制过程中存在两种形态不同的感染形式：IMV 和EEV［11，16］。病毒粒子有两种离开细胞的方式，最主要的一种是通过细胞裂解的方式，IMV被直接释放；
另一种通过细胞的分泌转运系统，利用高尔基体分泌到细胞外，该方式能够使病毒额外获得一层被膜从而产生EEV。IMV 和EEV 表达不同的病毒蛋白，形成独特的抗原特征，以区分两种形式的病毒粒子。
2.1 目前使用的疫苗现状 据WHO 报道，正痘病毒免疫反应能够提供交叉保护，观察性研究表明，接种天花疫苗预防猴痘的有效性约为85%，之前接种过天花疫苗可能会降低MPXV 感染导致的病情严重程度［10］。但1981年以后，全球逐步停止接种天花疫苗，40 岁以下人群对MPXV 缺乏足够的免疫力。随着猴痘疫情的扩散，猴痘疫苗将会成为应对疫情的重要工具。截止目前，改良减毒非复制型牛痘病毒（安卡拉毒株）疫苗JYNNEOS（Imvamune、Imvanex、MVA-BN，一种复制缺陷型减毒疫苗）是美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）唯一批准的猴痘疫苗，除了在接触MPXV 前接种用于预防之外，在暴露后接种也可能有助于预防疾病或减轻其严重程度［17-18］。该疫苗由丹麦生技公司巴伐利亚北欧（Bavarian Nordic）生产，共需免疫2剂，间隔28 d。其安全性好于由美国Emergent BioSolutions生产的天花疫苗ACAM2000，并可保护动物免除致命的正痘病毒疾病，包括非人灵长类动物的MPXV感染、兔痘病毒感染和VACA 感染［19-20］。该疫苗于2018年获得美国FDA 批准上市，用于18岁以上高危成年人群天花和猴痘感染的预防，这是FDA 批准的唯一一款非复制型天花疫苗，也是世界上唯一一个获批的猴痘疫苗［21-22］。
2.2 正在研发的疫苗
2.2.1 MPXV 减毒疫苗 MPXV 与天花病毒亲缘关系较近，接种天花疫苗可提供交叉免疫。历史上用来预防天花的天花疫苗属于减毒活疫苗，对猴痘的保护率约为85%，但可能会产生不良的副反应［23］。SCHULTZ 等［24］通过非洲睡鼠模型评价天花疫苗对MPXV 感染的保护效力，给疫苗组非洲睡鼠接种1次天花疫苗，4 周后感染MPXV，其存活率为100%，而安慰剂组非洲睡鼠感染MPXV后存活率为0。HATCH等［25］通过食蟹猴模型评价第三代天花疫苗对MPXV感染的保护效力，实验结果表明，单次免疫第三代疫苗不能完全避免严重的致死性感染，而加强免疫后可有效保护食蟹猴。因此，可考虑在天花疫苗的基础上再进行减毒，研发MPXV减毒疫苗。以MVA-BN技术平台为基础，研发猴痘非复制型减毒疫苗，通过基因编辑技术，将决定细胞毒性和宿主范围的特异性基因进行敲除或修饰，提高疫苗的安全性，同时不降低其保护效力，开发出具有更高安全性和免疫原性的MPXV减毒疫苗。
2.2.2 MPXVmRNA 疫苗 mRNA 疫苗作为新型疫苗，在预防重大传染病中发挥了重要作用。2022年5月24日，mRNA 疫苗研发企业Moderna 公司宣布，将利用其mRNA 疫苗研发平台开展MPXV mRNA 疫苗的研发。与其他类型疫苗相比，mRNA 疫苗的设计与生产更为简便。mRNA 疫苗不通过体外培养病毒，直接将编码病毒抗原蛋白的mRNA 导入人体，从而节省了细胞培养、病毒收获和纯化等过程，大大缩短了生产时间，进而更易实现量产。mRNA 疫苗可同时诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，通过多种机制保护机体。MPXV mRNA 疫苗研发过程中，目的基因序列和mRNA 递送系统的设计是疫苗研发的重点和难点。筛选出MPXV 的最佳靶抗原是mRNA序列设计的关键点，这将在很大程度上决定疫苗的有效性和保护效力。另一方面，mRNA 疫苗在体内递送过程中，极易被降解，进而会影响疫苗的有效性。因此，设计高效稳定的递送系统对mRNA 疫苗顺利发挥作用至关重要。
用MPXV 实验动物模型来评价猴痘疫苗的有效性和保护效力是非常重要的方法。此外，这些实验动物模型还应用于药物筛选与评价、MPXV 传播的研究。
3.1 小鼠模型 4周龄BALB／c小鼠腹腔注射105PFU的MPXV 后5 d 内表现出被毛粗糙、食欲不振、皮肤水肿和活动减少等症状，并在感染后约10 d 恢复；
4周龄SCID-BALB／c小鼠（免疫缺陷）腹腔注射105PFU的MPXV 后第9 ～11 天死亡，死亡率为100%［26］。可在小鼠的肝、肺、肾、卵巢、腋窝淋巴结、肠道上皮、足部皮肤、尾部皮肤等位置检测到MPXV。6 ～7 周龄C57BL／6 小鼠和BALB／c 小鼠足部皮下注射或滴鼻感染105PFU 的MPXV，可导致体重减轻，但并不会导致死亡，而C57BL／6小鼠症状轻于BALB／c小鼠。在38 个近交系小鼠品系的筛选中，32 个经典品系均对MPXV的攻击具有抗性，而6个野生型品系中有3 个品系发生死亡。小鼠模型对研究MPXV 与人体免疫系统互作有一定的借鉴意义。
3.2 非洲睡鼠模型 非洲睡鼠是MPXV 的自然宿主之一，感染较低剂量的MPXV 即会出现严重的临床症状，如嗜睡、眯眼、被毛皱褶、僵硬和体温降低等，半数致死剂量（LD50）为12 PFU，肝脏中的病毒载量为109PFU／g，高于其他器官约1个对数［24］。睡鼠模型的多器官出血特性适用于研究天花出血机制，可用于评价疫苗的有效性及保护效力。
3.3 十三条纹地松鼠模型 十三条纹地松鼠经腹膜内和鼻内感染MPXV 后，会出现严重疾病，并在感染后第6 ～9 天死亡，在肝、脾、肾、肾上腺、肺、心脏和脑组织中均可检测到病毒，感染后第3 天可在血液中检测到病毒［27］。MPXV 可通过气溶胶在地松鼠之间传播，感染后的存活时间更短，病情程度更重，其适用于研究人感染MPXV后重症的发病机制。
3.4 黑尾土拨鼠模型 2 周岁黑尾土拨鼠通过滴鼻5×104PFU／10 μL MPXV 可有效感染，感染后第6、9、12、17天对黑尾土拨鼠进行安乐死处理，同时每天监测发病率及临床特征，收集口腔拭子、统计皮肤病变数。感染后第11 ～14 天，黑尾土拨鼠均表现出MPXV 相关临床特征，且有可见病变，所有黑尾土拨鼠均可检测出病毒载量，其中舌头与皮肤损伤部位最高。成年黑尾土拨鼠通过滴鼻104PFU／50 μL 病毒液可有效感染，感染后第1、3、5、7、9、11、13 天进行活体成像，病毒复制路径从鼻腔至腹部颈侧区城，随后至胸腹部；
血液中病毒滴度在感染后第13 ～18天达最高；
病理结果显示，皮肤组织呈现亚急性坏死皮炎，肺组织均有多灶性淋巴浆细胞性间质性肺炎，存在感染死亡及感染后恢复现象［28］。黑尾土拨鼠模型的特点是可出现典型的猴痘症状，且高剂量排毒，适用于猴痘发病机制和病毒传播研究。
3.5 食蟹猴模型
非人灵长类动物的猴痘模型主要有3 种感染方式：静脉注射感染、气溶胶暴露感染和气管内感染途径。
3.5.1 静脉注射感染 5 × 107PFU 为致死性剂量，通常用于疫苗、药物的有效性评价。动物在接种后7 ～14 d 死亡，表现为全身性水疱脓疱性皮疹和明显的淋巴结肿大。
3.5.2 气溶胶暴露感染 感染剂量在2.51 × 104～9.28 × 105PFU，LD50约为7.8 × 104PFU。感染后第4天，可在部分血液样本和咽拭子样本中检测到低水平的病毒［29］；
感染后第6 天，所有血液样本中均可检测到病毒，大部分咽拭子样本中可检测到病毒；
感染第14 天后，在血液和咽拭子样本中检测到的病毒水平极低。
3.5.3 气管内感染 5 × 104PFU 的感染剂量可成功感染，并出现病毒血症，但不会造成死亡；
5×105PFU的感染剂量有可能出现死亡个例。食蟹猴模型可模拟猴痘临床症状，适合于疫苗和药物的评价。
猴痘是一种危害极大的病毒传染病，不仅影响中非和西非等非洲国家，还影响整个世界，已成为全球公共卫生问题。随着猴痘疫情在世界范围内的快速蔓延，给社会带来巨大的健康威胁和经济损失。为了有效降低MPXV 的传播风险，增强猴痘疫情防患意识、加强MPXV 监测和国际合作至关重要。为消除猴痘疫情对人类健康和生命的威胁，须进一步提高人群对MPXV 的免疫保护水平，包括提高天花疫苗和抗MPXV 药物的储备，对高风险人群进行猴痘疫苗的预防接种，加快研发更加安全有效的猴痘疫苗，为猴痘疫情的防控提供切实有效的保障。
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