腐皮镰刀菌对人参根部生理变化的响应机制
时间：2022-12-05 20:05:03 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
冯 琳， 孙 茹， 赵贵佳， 赵 雨， 连文慧
(长春中医药大学 人参科学研究院， 长春 130117)
人参(PanaxginsengC.A.Meyer)为五加科人参属多年生草本植物的干燥根[1]， 是传统的名贵中药. 近年来， 随着人参栽培面积的不断增加， 人参根腐病快速蔓延[2]， 人参受根腐病病原菌侵染后会出现根部腐烂、 叶片发黄， 甚至死亡. 人参根腐病的主要病原菌为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和腐皮镰刀菌(Fusariumsolani). 张晶晶[3]对人参根腐病病原菌进行了鉴定与致病力检测， 结果表明， 腐皮镰刀菌致病力强于尖孢镰刀菌. 腐皮镰刀菌侵染植株后分泌毒素， 破坏其细胞膜系统， 导致寄主植株出现抵抗反应， 主要体现在生理生化和形态两方面. 郑磊等[4]利用腐皮镰刀菌病原菌侵染植株， 考察宿主植株的各种生理生化代谢反应与抗病性的关系， 结果表明， 侵染后的植物体生理生化指标发生显著变化， 可能与植物抗性有关. 当病原菌侵染宿主后， 为适应寄主体内环境， 病原菌分泌大量细胞壁降解酶(CWDEs)， 主要包括羧甲基纤维素酶(Cx)、β-葡萄糖苷酶(βG)、 聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、 多聚半乳糖醛酸酶(PG)、 果胶甲基反式消除酶(PGTE)、 多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PMTE)等， 以降解寄主植物的细胞壁和胞间层， 从而使病原菌对寄主体侵入、 定殖以及扩展. 目前， 对人参根腐病的研究文献报道较多[5]， 但对腐皮镰刀菌与寄主的细胞壁降解酶和植物防御酶响应机制的研究较少. 本文采用腐皮镰刀菌孢子悬浮液对人参进行人工侵染， 分析比较侵染后人参体内细胞壁降解酶和生理生化指标等的变化， 为研究根腐病菌的致病机理及其与寄主的响应机制提供理论参考.
1.1 材料和仪器
2～3年生人参购于吉林省抚松县参王植保有限责任公司；
供试病原菌由吉林农业大学杨利民教授分离并鉴定为腐皮镰刀菌；
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)和马铃薯葡萄糖肉汤(PD)购于北京奥博星生物技术有限责任公司；
丙氨酸解氨酶(PAL)、 超氧化物歧化酶(SOD)、 过氧化物(POD)、 多酚氧化酶(PPO)和过氧化氢酶(CAT)试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；
丙二醛(MDA)试剂盒购于南京建成生物工程研究所.
MJX智能型霉菌培养箱(宁波江南仪器厂)；
PQX-450H型人工气候箱(中仪国科(北京)科技有限公司)；
THZ-C型恒温振荡器(江苏太仓市实验设备厂)；
ECLIPSE TS2型显微镜(上海尼康仪器有限公司)；
Centrifuge 5804 R型离心机(德国Eppendorf公司)；
infinite M200 PRO型酶标仪(瑞士TECAN公司).
1.2 方 法
1.2.1 人参根腐病菌的活化和培养
用PDA培养基培养腐皮镰刀菌， 在霉菌培养箱(25 ℃)中培养3～5 d后， 用打孔器打取5个直径为5 mm 的菌片， 置于100 mL PD培养液中， 在恒温振荡器中(150 r/min， 25 ℃)震荡3～5 d后， 先用8层纱布滤除菌丝， 在显微镜下用血球计数板观察孢子数量， 再用无菌水稀释， 最终制成浓度为4×106cfu/mL 的腐皮镰刀菌病原菌孢子悬液(cfu为菌落数)， 置于4 ℃冰箱中备用[6].
1.2.2 人参根部病原菌侵染
先将2～3年生健康鲜人参根用清水洗净， 再用体积分数为75%的酒精浸泡10～15 s 后， 用无菌水冲洗3次， 备用. 用灭菌后的接种针在各人参根部相同部位进行梅花状刺伤， 且每个刺伤间隔约1 cm， 每根刺伤5处. 菌侵组在菌液中浸泡1 h， 对照(CK)组在无菌水中浸泡1 h[7]， 移植到花盆土壤中栽培， 置于人工气候箱(温度：
(22±1)℃， 湿度：
49%～51%)中培养. 整根取样， 取样时间为0，7，14，21，28 d， 重复3次. 所取样品用液氮速冻后， 于-80 ℃冰箱冻存.
1.2.3 根腐病菌侵染人参活体内细胞壁降解酶提取
分别在0,7,14,21,28 d 时， 取健康人参组织和发病人参组织各4 g 置于研钵中， 用液氮研磨至粉末状， 加入20 mL 0.25 mol/L NaCl提取液(含1.0 mol/L Tris-HCl缓冲液， pH=8.0)， 在冰浴中研磨成匀浆， 随后转入离心管中， 离心15 min(4 ℃， 10 000 r/min)， 取上清液即为粗酶液， 备用.
1.2.4 细胞壁降解酶活力测定
Cx，βG，PG和PMG活性测定：
取50 ℃水浴5 min 的柠檬酸缓冲液(0.05 mol/L， pH=4.5)0.5 mL 和质量分数为1%的底物溶液(Cx的底物是羧甲基纤维素钠，βG的底物是水杨苷， PG的底物是多聚半乳糖醛酸， PMG的底物是果胶)0.5 mL 置于试管中， 再加入0.5 mL 粗酶液， 于50 ℃酶解30～60 min， 加入DNS试剂1 mL， 在沸水中反应5 min后， 冷却至室温， 定容至6 mL， 在540 nm波长下测定吸光值(OD).
PGTE和PMTE活性测定：
取0.5 mL 酶液加入0.5 mL 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(0.05 mol/L， pH=9.0)和0.5 mL 底物溶液(PGTE的底物是多聚半乳糖醛酸， PMTE的底物是果胶)， 再加入0.5 mL CaCl2(3 mmol/L)， 在30 ℃水浴中反应10 min后， 定容至5 mL， 在232 nm波长下测定吸光值(OD).
1.2.5 根腐病菌侵染人参活体内植物防御酶及可溶性糖的提取和活力测定
PAL,SOD,POD,PPO,CAT,MDA提取与活力测定参照试剂盒说明进行， 可溶性糖的质量分数采用硫代巴比妥酸(Thiobarbituric acid， TBA)法测定[8].
1.2.6 数据分析
用SPSS 19.0软件进行数据统计分析， 并通过单因素方差分析对相关性指标进行显著性检验， 当p<0.05时， 具有显著性意义， 用GraphPad Prism 5软件绘图.
2.1 腐皮镰刀菌形态观察
腐皮镰刀菌菌落形态如图1所示. 将腐皮镰刀菌置于PDA培养基上培养5～7 d后， 观察到白色稀疏的菌丝体， 在显微镜下观察到大、 小型分生孢子， 大型分生孢子较长, 呈镰刀形， 长度约为8～18 μm， 小型分生孢子呈卵圆形或肾型.
图1 腐皮镰刀菌菌落形态及显微镜下形态Fig.1 Colony morphology and microscopic morphology of F.solani
2.2 腐皮镰刀菌侵染人参表观变化
人参接种无菌水和腐皮镰刀菌后的表观变化如图2所示. 由图2可见：
接种无菌水处理后的人参接种部位变化无明显差别；
接种腐皮镰刀菌后的人参接种部位颜色明显加深出现病斑， 病斑颜色呈深褐色， 并随着时间延长发病程度逐渐加重.
图2 人参接种无菌水和腐皮镰刀菌后的表观变化Fig.2 Apparent changes of P.ginseng after inoculation with sterile water and F.solani
2.3 腐皮镰刀菌侵染人参体内CWDEs活性变化
人参接种腐皮镰刀菌后CWDEs活性的变化如图3所示. 由图3可见：
菌侵组中两种纤维素酶Cx和βG活性峰值出现较早， 呈先上升后下降再趋于稳定的趋势， Cx在第7天时达到峰值， 随后急剧下降， 14 d 后趋于稳定，βG在第7天时达到峰值后下降；
对照(CK)组Cx前期无明显变化， 21 d 后略上升，βG无明显变化. 检测PG，PMG，PMTE和PGTE 4种果胶酶的活性， 结果表明， PG的活性明显高于其他几种酶， 菌侵组的PG活性在前14 d 无明显变化， 21 d 时达到酶活性峰值1.191 U/mg 后急剧下降(其中U定义为在室温下， 每分钟1 mL酶液催化底物释放1 μmol糖或酸类物质所需的酶量)， 对照组在0.8 U/mg 上下波动较小. 菌侵组PMG活性呈上下波动的趋势， 在第7天时达到0.262 U/mg 后略下降， 在第21天时达到0.314 U/mg， 随后急剧下降， 对照组无明显变化. 菌侵组PGTE和PMTE呈先升高后下降的趋势， 在第7天达到酶活性峰值， 对照组无明显变化. 综上可见， 两种纤维素酶Cx和βG活性峰值出现较早， 起主要作用的果胶酶是PG和PMG， 其中PG酶活性最高， 其次是Cx，PMG和βG， 菌侵组酶活性基本均高于空白对照组.
图3 人参接种腐皮镰刀菌后CWDEs活性的变化Fig.3 Changes of CWDEs activities of P.ginseng after inoculation with F.solani
2.4 腐皮镰刀菌侵染人参植物防御酶活性变化
2.4.1 SOD,POD和CAT的活性变化
SOD,POD和CAT的活性变化如图4所示. 由图4可见：
人参接种腐皮镰刀菌后， SOD活性随时间延长呈先上升后下降的趋势， 在14 d时， 酶活性达到高峰， 与对照组相比酶活性提高了20.34%， 随后出现显著性下落状态(p<0.05)；
对照组无较大波动趋势， 在21 d 前菌侵组的SOD活性始终高于对照组的活性水平. 人参接种腐皮镰刀菌后， 菌侵组POD活性呈先上升后下降再上升的趋势， 在接种腐皮镰刀菌后第28天时， 与接种第21天相比POD活性呈显著上升趋势(p<0.05)， 与对照组相比提高了65.13%；
对照组在7 d 时达到高峰随后下降趋于稳定， 前期对照组POD活性高于菌侵组， 后期菌侵组高于空白对照组. 经腐皮镰刀菌处理后， 菌侵组与对照组CAT活性变化波动较大；
菌侵组在0～7 d时活性略下降， 随后急剧上升， 14 d 时达到活性峰值197.890 U/g后呈下降趋势；
对照组前21 d活性变化波动较小， 第21天后CAT活性显著下降(p<0.05)， 至119.947 U/g.
图4 人参接种腐皮镰刀菌后SOD,POD和CAT的活性变化Fig.4 Change of SOD,POD and CAT activities of P.ginseng after inoculation with F.solani
2.4.2 PAL和PPO的活性变化
PAL和PPO的活性变化如图5所示. 由图5可见：
经腐皮镰刀菌侵染后， 菌侵组PAL活性呈先增加后稳定的趋势， 在第14天时达到活性峰值；
对照组呈下降趋势， 并且菌侵组始终高于对照组活性， 7，14，21 d分别比对照组增加12.51%，37.54%，18.75%；
菌侵组的PAL活性整体高于对照组的活性水平. 对照组PPO活性略有增加；
接种腐皮镰刀菌的人参PPO活性在0～7 d 时急剧上升， 达到峰值34.456 U/g， 随后急剧下降， 14 d后趋于稳定并低于空白对照组活性.
图5 人参接种腐皮镰刀菌后PAL和PPO的活性变化Fig.5 Change of PAL and PPO activities of P.ginsengafter inoculation with F.solani
2.4.3 可溶性糖的质量分数和MDA质量摩尔浓度的变化
可溶性糖的质量分数和MDA质量摩尔浓度的变化分别如图6和图7所示. 由图6可见， 菌侵组与对照组的可溶性糖质量分数呈逐渐下降趋势， 并且菌侵组始终高于对照组的质量分数. 由图7可见， 菌侵组和对照组MDA的质量摩尔浓度呈先升高后下降趋势， 在21 d时达到峰值， 并且菌侵组MDA低于对照组MDA的质量摩尔浓度.
图6 人参接种腐皮镰刀菌后可溶性糖质量分数的变化Fig.6 Changes of mass fraction of soluble sugar of P.ginseng after inoculation with F.solani
图7 人参接种腐皮镰刀菌后MDA质量摩尔浓度的变化Fig.7 Changes of mass molar concentration of MDA ofP.ginseng after inoculation with F.solani
病原菌入侵植物后， 初期会遇到细胞壁屏障， 在病原菌与植物识别的过程中， 病原菌释放细胞壁降解酶， 从而有利于其入侵[9-10]: 李宝聚等[11]研究黄瓜黑星病菌致病时发现细胞壁降解酶是主要的致病因素之一; 李喜玲[12]研究灰葡萄孢菌株的致病力与纤维素酶活力呈正相关， 灰霉菌果胶酶活力高低与致病力强弱也有一定的相关性. 上述研究结果, 表明纤维素酶和果胶酶是病原菌的两种重要致病因子. 本文研究了在腐皮镰刀菌侵染人参过程中， 人参根部组织细胞壁降解酶的变化趋势， 结果表明， 菌侵组PG活性最高， Cx和βG次之， PGTE和PMTE活性极低. 腐皮镰刀菌侵染人参时， 起主要作用的果胶酶是PG和PMG， 且活性峰值出现时间较纤维素酶Cx和βG晚. 果胶酶PG活性高于纤维素酶， 这可能是由于病原菌侵染寄主后先降解纤维素中的基质多糖和纤维二糖使其转化为葡萄糖， 随后降解细胞壁中的果胶所致. 并且大部分菌侵组细胞壁降解酶活性高于对照组， 进一步说明纤维素酶和果胶酶在腐皮镰刀菌侵染人参的致病过程中具有重要作用， 是主要的致病因子.
植物在酶催化下发生一系列生理生化代谢过程使植物产生防卫反应， 与植物的抗病性密切相关， 植物防御酶可作为检测植物抗病性的重要指标[13-15]. 抗氧化酶如POD，CAT和PPO被归为防御酶， 通常在活性氧代谢中发挥重要作用. 植物感染病原菌后， 体内活性氧的产生与消除代谢平衡被破坏， 导致代谢紊乱， SOD，POD和CAT活性增加表明清除自由基的能力增强， 可维持细胞正常代谢[16-18]. 李新等[19]研究了黄瓜感染枯萎病后的酶活性变化， 结果表明， POD,SOD,PPO和PAL可促进植物体产生多种次生代谢物质， 阻止病原菌的侵入和繁殖， 其活性与对照组相比均有不同程度的升高. 侯茜等[20]对西瓜枯萎病抗性关系的研究表明， POD和CAT活性与植物的抗病性呈正相关. 本文研究表明：
1) 菌侵组的SOD活性随时间的延长呈先升高后下降趋势， 菌侵组POD活性在28 d 时达到峰值， CAT活性在14 d 时达到峰值. 腐皮镰刀菌侵染人参后， 人参为抵御菌的侵染而做出应激反应， 增加了植物防御酶活性， 增强人参对根腐病的防御能力.
2) PAL和PPO作为苯丙烷代谢途径的限速酶和关键酶， 能够调控植物抗病相关的木质素和酚类物质的氧化和合成， 参与植物体内多种防卫反应[20]. 菌侵组PAL在14 d 达到峰值后呈稳定趋势， PPO活性在7 d 时出现峰值， 并且菌侵组酶活性高于对照组， 表明病原菌的入侵可能会诱导PPO和PAL活性水平升高， 人参防御机制被激活.
3) MDA是细胞膜的脂质过氧化作用的产物， 当植物感染病原菌后， 会抑制细胞膜内的膜脂过氧化反应[21-22]， 从而使MDA含量减少， 抗病性增强. 腐皮镰刀菌侵染人参后， 菌侵组MDA含量低于对照组. MDA含量减少， 抑制病原菌入侵， 使抗病性增强， 并延迟其积累， 这与赵秀娟等[23]研究酶活性、 MDA含量变化与苦瓜抗枯萎病性呈负相关相符.
4) 病原菌的侵染和扩展导致营养物质输导紊乱， 可能会引起可溶性糖含量变化， 菌侵组始终高于对照组的可溶性糖含量， 可能是机体呼吸作用增强， 促进了淀粉和纤维素等降解为可溶性糖所致， 是人参的一种自身保护性反应.
综上， 本文研究了腐皮镰刀菌侵染人参后， 人参根部细胞壁降解酶、 植物防御酶活性以及可溶性糖、 MDA含量变化趋势. 结果表明， 它们均与人参抗根腐病密切相关， 为腐皮镰刀菌病侵染人参机制的研究提供了理论依据.
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