替诺福韦、依非韦伦对拉米夫定在大鼠体内药动学的影响

余史丹，汪硕闻，唐原君，李红霞，竺东杰，范国荣2，*（.联勤保障部队第906医院药剂科，浙江 宁波 5040；
2.上海市药物（中药）代谢产物研究重点实验室，上海 2004；
.上海交通大学附属第一人民医院临床药学科，上海 200080）

获得性免疫缺陷综合征，简称艾滋病，是由人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染引起的一种严重威胁人类健康的传染性疾病[1]。高效抗逆转录病毒治疗法（highly active antiretroviral therapy，HAART）是现阶段艾滋病治疗最为有效的方法。国家推荐用于成人及青少年抗病毒治疗的三联疗法一般包括两种核苷类逆转录酶抑制剂（nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NRTIs）和一种非核苷类逆转录酶抑制剂（non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NNRTIs）[2-3]。其中，富马酸替诺福韦酯、拉米夫定联合依非韦伦为目前临床上推荐的初始抗病毒疗法的首选方案，疗效显著、不良反应少[4-6]。富马酸替诺福韦酯与拉米夫定同属于核苷类逆转录酶抑制剂。富马酸替诺福韦酯水溶性好，口服后水解生成替诺福韦，竞争性地结合逆转录酶从而抑制HIV 病毒复制[7]。拉米夫定口服吸收良好，代谢生成三磷酸拉米夫定，阻断病毒DNA 链的合成和延长从而发挥抗病毒作用[8]。依非韦伦作为一种选择性非核苷类逆转录酶抑制剂，对HIV-1逆转录酶产生非竞争性抑制作用，阻碍病毒复制而发挥疗效[9]，三者联用协同发挥抗病毒作用。

降低用药剂量，减少不良反应发生率、增加依从性和降低耐药的发生是目前艾滋病治疗新方案的研究方向。本试验研究的新型抗艾滋病复方药物（拉米夫定300 mg ＋富马酸替诺福韦酯200 mg ＋依非韦伦400 mg）是何志明院士团队基于反馈系统控制平台体系（Feedback System Control，FSC）对临床常用的多种抗病毒药物进行筛选、重组和剂量优化得到的高效、低毒的药物组合[10]。与目前临床上常用的一线治疗方案（拉米夫定 300 mg ＋富马酸替诺福韦酯300 mg ＋依非韦伦 600 mg）相比，组合相同，剂量较低，有利于减轻药物不良反应，降低用药成本，提高患者用药依从性[11-13]。

药物联合使用常可达到增效减毒的目的，但也存在疗效降低、毒副作用增强等风险，药动学相互作用是导致其发生的重要机制之一[14-15]。已有研究报道联用替诺福韦及地达诺新后拉米夫定的AUC0～∞保持不变，Cmax降低，tmax增加，但差异不具有统计学意义[16]。Jiang 等[17]对大鼠口服恩替卡韦和拉米夫定后拉米夫定的药动学进行研究，未发现显著药物相互作用。Ceckova 等[18]研究发现联用依非韦伦后拉米夫定的血浆清除率（CL）显著降低，t1/2延长，AUC0～∞增加，减少了其在大鼠体内的肾脏排泄。目前拉米夫定联用富马酸替诺福韦酯、依非韦伦后是否存在药动学相互作用尚未见相关报道。

本实验建立了一种快速、灵敏的UFLC-MS/MS 法测定大鼠血浆中拉米夫定的浓度，并应用于研究新型抗艾滋病复方药物中富马酸替诺福韦酯、依非韦伦对拉米夫定在大鼠体内药动学行为的影响，探讨可能存在的药动学相互作用，为抗病毒药物临床安全、合理使用提供参考。

1.1 仪器

SHIMADZU UFLC-20A（配备CBM-20A 控制器，DGU-20A3 在线脱气机，LC-20AD 高压梯度泵，SIL-20A 自动进样器和CTO-20AC 柱温箱，日本岛津公司），API 4000 三重四级杆串联质谱仪、Analyst 1.6 色谱质谱工作站（美国AB Sciex 公司），SCILOGEX MX-S 涡旋混合器（美国Scilogex 公司），SORVALL LEGEND Micro 21R 冷冻离心机（美国Thermo Scientific 公司），XS205 Dual Range 电子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司），SK5200H超声仪（上海科导超声仪器有限公司），Hi-Tech 水纯化系统（上海和泰仪器有限公司）。

1.2 试药

替诺福韦对照品（含量＞99%，批号：MO426AS）、依非韦伦对照品（含量＞99%，批号：MO202AS）、拉米夫定对照品（含量＞99%，批号：MO222AS）、内标阿昔洛韦对照品（含量＞99%，批号：JO610AS）、富马酸替诺福韦酯原料药（含量＞98%，批号：MB1237）、依非韦仑原料药（含量＞98%，批号：MB3218）、拉米夫定原料药（含量＞98%，批号：MB1889）（大连美仑生物技术有限公司）。

甲醇（色谱纯，德国Merck）；
乙酸铵（分析纯，上海泰坦化学有限公司）；
甲酸（色谱纯，上海安谱公司）；
水为Hi-Tech 水纯化系统自制的去离子超纯水（18.2 MΩ）。

1.3 实验动物

SPF 级成年、健康Sprague-Dawley 大鼠，180 ～220 g，雌雄兼顾[上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2013-0016]。所有的动物实验均符合海军军医大学动物伦理委员会规定。

2.1 分析条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱Agilent ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱温30℃，流动相A 为含0.1%甲酸和25 mmol·L－1乙酸铵的去离子水，流动相B 为甲醇，梯度洗脱（0.01 ～0.30 min，40% ～70%B；
0.31 ～2.40 min，70%B；
2.41 ～3.00 min，40%B）；
流速1 mL·min－1，柱后分流比3∶7，进样量5 μL，分析时间3 min。

2.1.2 质谱条件 采用电喷雾离子源（ESI），正离子检测模式，选择多反应监测（MRM）方式进行一/二级质谱分析。源参数：源电压5500 V，Gas1 50 psi，Gas2 45 psi，CUR 20 psi，CAD 10 psi，离子源温度500℃；
各化合物的一/二级离子和质谱特征性参数见表1，二级质谱图见图1。

图1 各分析物及内标的离子质谱图Fig 1 Product ion mass spectra of each analyte and the internal standard

表1 各分析物及内标用于定量分析的离子通道及优化后的质谱参数Tab 1 Mass parameters and MRM transitions optimized for quantitative analysis of each analyte and the internal standard

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液的配制 精密称取拉米夫定对照品约10 mg，置于10 mL 棕色量瓶中，加入50%甲醇配制成质量浓度为1 mg·mL－1的储备液。将储备液用50%甲醇溶液逐级稀释得到拉米夫定质量浓度分别为100、200、500、1000、5000、10 000、18 000、20 000 ng·mL－1的系列工作溶液，同法配制含拉米夫定质量浓度为300、2500 和16 000 ng·mL－1的质控工作溶液。

2.2.2 内标阿昔洛韦溶液的配制 精密称取阿昔洛韦对照品约10 mg，置于10 mL 量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，得质量浓度为1 mg·mL－1的标准储备液。用50%甲醇水溶液稀释后得质量浓度为1000 ng·mL－1的内标阿昔洛韦工作溶液。以上所有溶液均置于－20℃保存。

2.3 血浆样品的前处理

血浆样品采用96 孔板（美国Waters）蛋白沉淀高通量前处理方法。每一批次分析样品随行标准曲线的配制，质控样品和实测样品的加样均在同一块96孔板上完成。采用自动多通道移液器（瑞士INTEGRA）在孔内准确加入50 μL 血浆、5 μL内标阿昔洛韦溶液（1000 ng·mL－1）和150 μL 甲醇进行蛋白沉淀，96 孔板封盖并涡旋振荡3 min，置于正压装置（美国Waters）下滤过提取5 min，随后移取滤液至进样小瓶中，自动进样5 μL 进行UFLC-MS/MS 分析，峰面积内标法定量检测。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性实验 通过对6 批不同来源SD 大鼠空白血浆、空白血浆标准添加定量下限（lower limit of quantitation，LLOQ）浓度水平标准溶液、实测血浆样品进行比较以考察方法的专属性。结果SD 大鼠血浆样品中拉米夫定及内标阿昔洛韦的保留时间分别为2.20、1.95 min，血浆内源性及其他物质对分析物及内标的测定无明显干扰，如图2 所示，表明该方法专属性良好。

图2 大鼠血浆中拉米夫定及内标阿昔洛韦的典型图谱Fig 2 Representative MRM chromatogram of lamivudine and the internal standard in the rat plasma

2.4.2 LLOQ 和线性范围 精密吸取拉米夫定工作溶液5 μL，加入SD 大鼠空白血浆45 μL，配制成含拉米夫定约10、20、50、100、500、1000、1800 和2000 ng·mL－1的血浆样品，按“2.3”项下方法操作，进样分析。以分析物与内标的峰面积比值（Y）对相应的质量浓度（X）进行加权（1/χ2）线性回归，得拉米夫定的标准曲线方程为Y＝0.0271X＋0.0528（r＝0.9995）。结果表明，SD 大鼠血浆中拉米夫定在10.26 ～2052 ng·mL－1与峰面积线性关系良好，LLOQ 为10.26 ng·mL－1（S/N＞10）。

2.4.3 精密度和准确度实验 配制含拉米夫定的LLOQ 样品和低、中、高3 个浓度水平的质控样品（每一浓度平行配制6 份），按“2.3”项下方法处理后进样分析，连续3 d 分别进样3 个分析批进行测定。根据当日建立的标准曲线分析LLOQ样品和质控样品，将测得浓度与理论浓度比较，计算准确度及日内、日间精密度。结果显示，拉米夫定日内、日间精密度RSD均小于10%，准确度为92.23%～103.10%，表明该方法准确、可靠，且重复性好，结果见表2。

表2 SD 大鼠血浆中拉米夫定的日内、日间精密度及准确度Tab 2 Precision and accuracy of lamivudine in SD rat plasma

2.4.4 回收率及基质效应 配制含拉米夫定低、中、高3 个浓度水平的质控样品（每一浓度平行配制6 份），按“2.3”项下方法处理，进样检测得峰面积A；
另取6 批不同来源的SD 大鼠空白血浆样品，按“2.3”项下方法加入沉淀剂制备空白基质上清液，加入相应浓度的质控工作溶液（每批次每一浓度平行配制3 份，共6 批），进样分析得峰面积B；
直接进样分析相应浓度的质控工作溶液得峰面积C；
按A/B×100%计算各浓度水平下拉米夫定及内标阿昔洛韦的提取回收率，按B/C×100%计算各浓度水平下拉米夫定及内标阿昔洛韦的基质基质因子，进一步计算得经内标归一化的基质因子，结果见表3。拉米夫定在低、中、高3 个质控浓度下的回收率及基质效应均较一致。

表3 SD 大鼠血浆中拉米夫定及内标阿昔洛韦的回收率和基质效应Tab 3 Recovery and matrix effect of lamivudine and IS in SD rat plasma

2.4.5 稀释效应 配制含拉米夫定质量浓度为3200、8000、16 000 和32 000 ng·mL－1的SD大鼠血浆质控样品各5 份，分别用空白血浆稀释2、5、10 和20 倍，按“2.3”项下方法处理后进行UFLC-MS/MS 分析。结果显示，血浆稀释2、5、10、20 倍后测得值与理论值的平均相对误差（RE）分别为0.70%、1.74%、2.33%和2.53%，RSD值均小于5%，表明高质量浓度血浆样品经稀释后不影响测定。

2.4.6 残留 配制标准添加定量上限（upper limit of quantification，ULOQ）质量浓度（2000 ng·mL－1）水平的血浆样品，按“2.3”项下方法处理后进样分析。通过进样标准添加ULOQ 水平的血浆样品后，紧接着连续进样空白溶剂估计残留。结果表明，在该分析方法下，空白溶剂中拉米夫定峰面积与相应分析批ULOQ 峰面积之比均小于15%，且不超过内标的1.5%。

2.4.7 交叉串扰 吸取拉米夫定储备液适量，用50%甲醇稀释制得其ULOQ 溶液（2000 ng·mL－1）。取水代空白血浆50 μL，按“2.3”项下方法制备不含内标的ULOQ 样品及仅含内标的IS 样品。结果表明，拉米夫定、内标各通道间无交叉串扰，如图3 所示。

图3 拉米夫定及内标阿昔洛韦的典型图谱Fig 3 Representative MRM chromatogram of lamivudine and acyclovir（IS）

2.4.8 稳定性 配制低、高质量浓度（30、1600 ng·mL－1）的拉米夫定血浆标准样品，按“2.3”项下方法操作处理后进样分析，考察样品处理、进样分析及储存过程中的稳定性。含拉米夫定的血浆样品室温下放置4 h 稳定，RE为－3.37%～6.44%，RSD＜2.3%；
处理后样品在自动进样器中放置12 h稳定，RE为－1.57%～7.21%，RSD＜4.6%；
样品经三次冻融循环（－80℃）后稳定，RE为－2.22%～10.61%，RSD均＜3.2%；
样品在－80℃冰箱冷冻保存60 d 后稳定，RE为－1.26%～3.17%，RSD均＜0.87%。结果表明，拉米夫定血浆样品在样品处理、分析及储存过程中稳定性良好。

2.5 药动学研究

选用12 只成年、健康SD 大鼠，雌雄各半，随机分为单独给药组和联合给药组。禁食过夜后，分别灌胃给药拉米夫定32 mg·kg－1，拉米夫定32 mg·kg－1＋富马酸替诺福韦酯21 mg·kg－1＋依非韦伦43 mg·kg－1（等效剂量通过体表面积法换算而得），于给药前（空白对照）及给药后5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h 从大鼠眼眶取血300 μL 置于涂有肝素的EP 管中，6500 r·min－1离心5 min，取上清液置于－80 ℃冰箱保存。血浆样品按“2.3”项下方法处理后进行UFLC-MS/MS分析。以非房室模型（统计矩法）经DAS 2.0 软件计算药动学参数。采用独立样本t检验对药动学参数进行统计学分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。平均血药浓度-时间曲线见图4，药动学参数见表4。

表4 SD 大鼠单独给药和联合给药后拉米夫定的药动学参数Tab 4 Pharmacokinetic parameters of lamivudine in SD rats after a single and combination administration

图4 SD 大鼠单独给药和联合给药后血浆中拉米夫定的平均药-时曲线Fig 4 Mean plasma concentration-time curves of lamivudine in SD rat plasma after a single and combination administration

从表4 中可以看出，单独给药组和联合给药组大鼠血浆中拉米夫定均于给药后1 h 达峰，Cmax分别 为4178.95 ng·mL－1和4598.86 ng·mL－1，AUC0～τ分别为14 917.86 ng·h·mL－1和13 728.50 ng·h·mL－1，t1/2z分别为1.50 h 和1.63 h，P值均大于0.05，药动学参数变化差异无统计学意义，提示联合使用替诺福韦与依非韦伦对拉米夫定在大鼠体内的药动学行为无明显影响。

文献报道生物基质中拉米夫定的测定多采用高效液相色谱法（HPLC-UV）、液相色谱-质谱串联法（LC-MS/MS）等，存在灵敏度低[19]、血浆用量大[20-21]、样品前处理过程烦琐[22-23]、分析时间长[24-25]等局限。本实验建立了一种快速、简便、专属性好的UFLC-MS/MS 方法测定大鼠血浆中拉米夫定的浓度，分析时间仅为3 min，分析过程中血浆用量少，仅需50 μL。通过考察不同有机溶剂（甲醇、乙腈），分别按1∶2、1∶3、1∶5（血浆样品∶有机溶剂）沉淀蛋白处理，结果表明使用甲醇1∶3沉淀蛋白时，拉米夫定的色谱峰峰形良好，基质干扰小，灵敏度及回收率等均符合分析要求。同时采用96孔板系统对血浆样品进行蛋白沉淀处理，显著缩短了样品处理时间，提高了样品处理效率，实现了大规模样品的高通量分析。

本研究首次考察了富马酸替诺福韦酯、依非韦伦对拉米夫定在大鼠体内药动学过程的影响。结果表明，联用替诺福韦、依非韦伦使拉米夫定的Cmax、CL增加，AUC0～∞减少，但差异无统计学意义（P＞0.05），提示无显著药动学相互作用存在。拉米夫定主要以原形药物由肾小球滤过、肾小管分泌排泄，部分通过有机阳离子转运系统经肾脏排出，约占其总清除量的70%[26]。作为转运体OCT2、MATE1 和MATE2-K 的底物，当与此类转运体抑制剂联用时可降低拉米夫定的肾脏清除率[27-28]。替诺福韦系统代谢极少，主要通过肾小球滤过及活性小管分泌（OAT1 和OAT3 转运至基底膜肾小管上皮细胞，由MRP4 分泌至肾小管管腔）联合作用排泄[29-30]。尽管替诺福韦、拉米夫定均主要经肾脏消除，但本研究结果提示无显著药动学相互作用存在，与Kearney 等[16]报道的研究结果一致，分析原因可能与其排泄过程中的药物转运蛋白不同有关。研究报道，一定浓度的依非韦伦可通过抑制MATE1、OCT1、OCT2 和MRP2 转运体而减少拉米夫定在大鼠肾脏中的排泄[18]，但在本研究中未观察到拉米夫定CL、t1/2、AUC0～∞等药动学参数的显著变化，考虑与本实验中给药剂量较低（依非韦伦 400 mg）有关，需进一步探究。拉米夫定、富马酸替诺福韦酯及依非韦伦联合用于艾滋病抗病毒治疗，临床上需长期给药[31]。本实验仅考察了单剂量富马酸替诺福韦酯、依非韦伦对拉米夫定的影响，具有一定的局限性，针对多剂量富马酸替诺福韦酯、依非韦伦对拉米夫定药动学影响及其具体作用机制有待后续进一步研究。

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