辣椒组织总RNA两种提取方法比较及qRT-PCR验证
时间：2022-12-02 10:20:03 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
牛西强， 罗潇云， 胡能兵， 黄先忠
(安徽科技学院 农学院，安徽 凤阳 233100)
提取高质量的植物组织总RNA是进行反转录PCR(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、转录组测序和基因克隆等分子生物学实验的基础和前提。不同于动物细胞，由于植物细胞壁中存在较多的多糖、多酚和萜类等次生代谢物质，增加了植物组织总RNA的提取难度。并且，因为不同植物或同一植物不同组织结构和次生代谢物存在差异，提取组织总RNA的方法也不尽相同。目前常用的提取植物组织总RNA方法有CTAB法、异硫氰酸胍法、SDS-酚抽提法，以及现在很多生物技术公司开发的试剂盒，如Trizol Reagent试剂和RNAprep Pure等。植物组织总RNA提取最关键的是防止降解和污染，要获得完整性好和纯度高的总RNA，植物组织破碎要迅速和充分。植物科学研究中，选择一个研究材料从事分子生物学方面研究，往往首先从RNA开始。因此需要在自己的实验室建立一套成熟的RNA分离、基因表达的体系，方可进入更深层次的研究。应根据不同植物材料的特点，选择恰当的方法提取高质量植物组织总RNA，反转录成cDNA，进行基因克隆和基因表达分析等实验内容。
辣椒(Capsicum
annuum
L.)富含维生素C和辣椒素等多种营养物质，是一种深受人们喜爱的经济蔬菜作物。辣椒在我国的种植面积仅次于白菜。随着辣椒的广泛栽培，对优良品种的需求更高了，常规育种已不能满足需要，分子育种将成为一种必然趋势。辣椒分子育种依赖于对控制辣椒农艺性状重要功能基因的功能鉴定、功能解析、代谢调控通路的深入解析。这些研究，离不开辣椒各种组织的高质量总RNA，然而提取辣椒组织总RNA的难度却非常大，因为辣椒组织中富含多糖多酚等次生代谢物。目前，辣椒根、茎、叶和幼果的总RNA提取方法研究已有报道。但是，未见辣椒顶端分生组织(shoot apical meristem，SAM)、下胚轴、花和子叶等组织总RNA提取方法的报道。综上所述，既有研究主要是针对辣椒少数组织总RNA提取方法的研究，但不能满足基因组织表达分析和分子育种对较多组织总RNA的需求。本研究以辣椒幼嫩的根、下胚轴、茎、叶、SAM、花和果实等为实验材料，探索一种适合辣椒较多组织总RNA的提取方法。通过借鉴前人的总RNA提取方法和预实验结果分析，本实验室开展了Trizol Reagent和RNAprep Pure两种方法，进行辣椒不同组织总RNA提取实验。通过比较2种方法所得辣椒组织总RNA的完整性、纯度和浓度、RT-PCR扩增内参基因和qRT-PCR定量分析目的基因组织表达，找出辣椒不同组织总RNA提取的较好方法，并且建立辣椒组织表达分析的实验技术体系。本研究为辣椒的分子遗传学和功能基因组学研究奠定了很好的试验基础。
1.1 供试材料
试验材料由安徽科技学院辣椒遗传育种课题组提供的1年生辣椒的自交系(编号为G7)。辣椒种子先用50孔穴盘育苗，然后移栽到温室大棚中。待辣椒生长至3～5片真叶时取根、下胚轴、茎、叶和SAM样品，花取样于开花坐果期，果实取样于花后10 d (果实长约10 cm)。所采集样品放在液氮中速冻，然后-80 ℃下冰箱中保存备用。
TRIzolReagent试剂盒购自Invitrogen公司；
RNAprep Pure植物总RAN提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；
DNA分子量标准Marker A (25～500 bp)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；
50 bp DNA Ladder Marker (PM106)、HiPro(H-) 1st Strand cDNA Synthesis Kit With gDNA Eraser、2×Taq PCR Master Mix(Dye Plus)和ProQqPCR EvaGreen Master Mix试剂盒购自普鲁顿公司(北京)；
50 bp DNA Ladder Marker (PM106)。
1.2 辣椒不同组织总RNA提取方法
Trizol Reagent试剂提取方法参照孙国胜等方法进行，并略有改良：(1)在2 mL离心管中加1 mL的Trizol Reagent裂解液，然后加20 μL的β-巯基乙醇，混匀后放在65 ℃水浴中加热10 min；
(2)取100 mg辣椒组织，置于预冷的研钵中，倒入液氮迅速研磨成粉状，转移到步骤(1)的离心管中，用涡旋混合仪混匀，室温静置10 min。4 ℃、12 000 r/min离心15 min，弃沉淀，把上清液转移到新的2 mL离心管中。(3)加入0.2 mL氯仿，涡旋混合仪混匀，静置2 min。4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液于新的离心管中。(4)加入0.5 mL异丙醇，振荡混匀，室温静置10 min。4 ℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清液。(5)加入1 mL用RNase Free ddHO配制的75%乙醇，枪头轻轻吸打洗涤沉淀。4 ℃、7 500 r/min离心5 min，弃上清液。(6)晾干，加入50 μL的RNase Free ddHO溶解。天根RNAprep Pure试剂盒法提取总RNA，参照天根RNAprep Pure试剂盒说明书进行。
1.3 RNA质量检测
用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测辣椒各组织总RNA的完整性，点样量为2 μL，在0.5×TBE缓冲液中进行，用全自动数码凝胶图像分析仪(Tanon，GIS 2500)检测RNA条带和拍照。每种辣椒组织总RNA取1 μL，用超微量分光光度计(NanoDrop 2000c, 美国)检测辣椒组织总RNA的纯度，测定其OD和OD值及其浓度。
1.4 RT-PCR和qRT-PCR反应
采用HiPro(H-) 1st Strand cDNA Synthesis Kit with gDNA Eraser试剂盒，选取辣椒的根、下胚轴、茎、叶、SAM、花和果实总RNA各100 ng进行反转录，合成cDNA的第一条链，-20 ℃保存备用。根据1年生辣椒的自我修剪(SELF
-PRUNING
)基因CaSP
的coding region sequence序列设计引物，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GaGAPDH
)为内参基因。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。
表1 CaGAPDH和CaSP基因的引物
以反转录获得的辣椒不同组织cDNA为模板，进行RT-PCR和qRT-PCR实验。RT-PCR扩增CaGAPDH
基因。反应体系(20 μL)：10 μL 2×Taq PCR Master Mix(Dye Plus)，上下游引物各0.5 μL，2 μL cDNA模板，7 μL.ddHO。反应程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环后72 ℃延伸7 min。用ProQqPCR EvaGreen Master Mix试剂盒进行qRT-PCR定量分析CaSP
基因在根、茎、叶和花中组织表达模式。qRT-PCR反应体系(25 μL)：2 μL cDNA模板，上下游引物各0.5 μL，10 μL ProQqPCR EvaGreen Master Mix，12 μL ddHO。反应程序：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s， 72 ℃延伸30 s，40个循环，重复3次。基因的相对表达量采用2计算。反应结束后，利用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR和qRT-PCR的反应产物。2.1 总RNA完整性和纯度分析
RNA主要成分是28 S RNA和18 S RNA，根据图1中28 S和18 S RNA条带分布，可以判断RNA的完整性和有无污染。改良Trizol Reagent试剂法提取的辣椒组织总RNA琼脂糖凝胶电泳结果(图1A)表明，总RNA条带均清晰明亮，说明产量较高。基本无拖带现象，且28 S RNA条带的亮度大约是18 S RNA 的2倍，说明提取的辣椒组织总RNA质量好，很少有降解。RNAprep Pure试剂盒提取的辣椒根、下胚轴、茎、叶、SAM、花和果实的总RNA条带清晰可见，但带的亮度较弱，且28 S和18 S条带的宽度和亮度基本一致(图1B)，暗示RNA的含量较低和有部分降解。通过辣椒根、下胚轴、茎、叶、SAM、花和果实的总RNA琼脂糖凝胶电泳分析(图1)，发现两种方法提取的辣椒根、花和果实总RNA带的亮度基本相当，而Trizol Reagent提取的辣椒下胚轴、茎、SAM和叶总RNA带明显较亮。根据RNA条带的亮度和完整性比较，Trizol Reagent试剂盒提取的辣椒组织总RNA质量相对较好。
图1 辣椒不同组织总RNA琼脂糖凝胶电泳
经NanoDrop 2000c检测总RNA浓度表明(表2)，Trizol Reagent试剂提取的辣椒组织总RNA的OD/OD比值为1.82～2.07，说明总RNA的纯度较好。RNAprep Pure试剂盒法提取的辣椒组织总RNA的OD/OD比值为1.93～2.15，说明总RNA纯度较差，暗示有部分降解。并且Trizol Reagent提取总RNA得率高于RNAprep Pure(表2)，这与Trizol Reagent提取的总RNA电泳条带亮度和宽度均大于RNAprep Pure相一致。通过2种方法提取辣椒组织总RNA的纯度和得率比较，Trizol Reagent试剂盒更适合辣椒不同组织总RNA的提取。
表2 2种方法提取的辣椒不同组织总RNA纯度和浓度比较
2.2 内参基因扩增和目的基因组织表达分析
为检测提取的辣椒总RNA能否满足RT-PCR扩增基因和qRT-PCR组织表达分析要求，选用Trizol Reagent试剂提取的辣椒总RNA反转录的cDNA为模板，进行CaGAPDH
的RT-PCR扩增和CaSP
的qRT-PCR组织表达分析试验。利用1.2%琼脂糖凝胶，将CaGAPDH
基因的RT-PCR扩增产物进行电泳和拍照(图2)。结果表明，Trizol Reagent方法提取的辣椒组织总RNA能扩增出CaGAPDH
的276 bp清晰明亮的特异性条带，且无杂带。表明Trizol Reagent方法提取的辣椒组织总RNA能满足RT-PCR的实验要求。利用qRT-PCR定量分析CaSP
基因在根、茎、叶和花中表达特征。结果表明，CaSP
基因在不同组织中均能表达，且差异明显(图3)。CaSP
在花中表达量最高，根中次之，在茎和叶中低表达(图3A)。并对qRT-PCR反应产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳分析(图3B)，电泳结果与qRT-PCR结果相一致。由此可知，Trizol Reagent方法提取的辣椒组织总RNA可用于后续的qRT-PCR组织表达分析。
图2 CaGAPDH基因的RT-PCR扩增产物电泳分析
图3 CaSP基因在辣椒不同组织中表达量比较
在选择育种、杂交育种和种质资源收集等基础研究方面，安徽科技学院辣椒遗传育种课题组取得了显著成绩。目前，课题组已培育出12个品种系列，收集1 500种优质种质资源，其中核心种质资源300种。利用聚合杂交、种间杂交和回交转育等方法，课题组培育出雄性不育系1110 A和其相应保持系1110 B，实现了3系配套育种。课题组近年来主要致力于不同辣椒品系组合材料的比较研究，并筛选出适合大棚栽培和不同成熟期收获的高产优质品种。前期的研究成果为开展辣椒分子育种奠定了坚实基础，分子育种离不开辣椒分子生物学的研究。为加快课题组辣椒分子育种的进程，亟待建立一整套完善的辣椒组织总RNA提取方法。
异硫氰酸胍法、CTAB法、SDS-酚抽提法、Trizol Reagent试剂法、RNAprep Pure试剂盒法等，提取过程都包含植物组织的裂解、RNA的分离、RNA的洗涤和DEPC水溶解。Trizol Reagent试剂中的异硫氰酸胍能够迅速的裂解组织细胞，使蛋白与核酸分离，释放RNA。利用Trizol Reagent试剂提取植物组织总RNA时，常常需加入β-巯基乙醇或苯酚。β-巯基乙醇是一种强还原剂，可以防止植物组织中酚类物质的氧化。苯酚能够有效促进RNA进入水相，提高RNA的获得率和纯度。本研究对Trizol Reagent试剂稍做改良，加入适量的β-巯基乙醇，并用65 ℃水浴加热10 min，有利于辣椒组织细胞的裂解和RNA的分离，提高辣椒组织总RNA质量。RNAprep Pure试剂盒是根据RNA提取的原理开发出来的，它的裂解液主要成分也是异硫氰酸胍，使用时需要加一定比例的β-巯基乙醇。不同的RNA提取方法各有优缺点，应根据不同植物组织的特点，选择合适的方法。
由于辣椒不同组织中次生代谢物、蛋白质和总RNA含量的不同，提取方法也不尽相同。比如,辣椒叶的适宜提取方法有王艳红法、RNAplant试剂法和尿素提取法；
根的适宜提取方法有改良CTAB法、RNAplant试剂法和Trizol Reagent试剂法；
茎的适宜提取方法有RNAplant试剂法和王艳红法。王艳红法、RNAplant和Trizol Reagent试剂法均利用异硫氰酸胍裂解植物组织细胞，促使RNA与核蛋白分离。尿素提取法是利用高浓度尿素能抑制RNA酶的活性，促进蛋白质和核酸的分离。李燕凌等用3种方法提取的辣椒根、茎和叶的总RNA电泳条带和浓度，均说明辣椒根和茎的总RNA含量低于叶片，这可能与辣椒根和茎等老化组织中的RNA含量较低和富含多糖多酚的影响有关。
利用1.2%琼脂糖凝胶电泳分析，发现Trizol Reagent提取的辣椒根和茎组织的总RNA含量低于叶(图1A)，结果与李燕凌等研究结果相一致，表明辣椒根和茎的总RNA提取难度较大。Trizol Reagent提取的辣椒总RNA能进行RT-PCR基因的扩增和qRT-PCR定量分析实验，可知Trizol Reagent提取的辣椒不同组织总RNA质量较高，暗示Trizol Reagent可作为辣椒不同组织总RNA提取的通用方法。进一步比较Trizol Reagent和RNAprep Pure提取辣椒组织总RNA的操作复杂程度、实验时长和经济成本，均说明Trizol Reagent是提取辣椒组织总RNA的较好方法。综合分析，Trizol Reagent将作为本实验室提取辣椒组织总RNA的较成熟方法，同时建立了成熟的辣椒组织表达的qRT-PCR定量分析体系。随着本实验室辣椒分子研究领域的拓宽，还需要不断的借鉴和改进RNA的提取方法，以满足后续研究的需求。
