鲍曼不动杆菌分子流行病学研究进展:鲍曼不动杆菌专家共识

　　[摘要] 介绍了鲍曼不动杆菌的分子流行病学特征，并比较了鲍曼不动杆菌几种分子分型方法的优缺点。 　　[关键词] 鲍曼不动杆菌 分子流行病学 分子分型 　　 　　 　　流行病学的研究对象是某种疾病在特定人群中发生、传播、预防、控制的影响因素，暴发性感染及其病原微生物的研究是流行病学研究的重要内容。分子流行病学是流行病学的重要领域，它的主要工作是通过追溯病原体来源，为判断暴发性感染的范围、扑灭疫情、制订预防策略提供重要依据。上世纪80年代以来，DNA分子分型作为分子流行病学的重要技术迅猛发展，并为流行性感染的预防和控制提供了重要信息。 　　1 不动杆菌的分子流行病学 　　不动杆菌属（Acinetobacter）是需氧、不发酵糖类的革兰氏阴性杆菌，可分为6种：醋酸钙不动杆菌（A. calcoaceticus）、鲁菲不动杆菌（A. lwoffi）、鲍曼不动杆菌（A. baumanii）、溶血不动杆菌（A. haemolytius）、琼氏不动杆菌（A. junii）和约翰逊不动杆菌（A. johnsonii）。 　　不动杆菌是机会致病菌，鲍曼不动杆菌、不动杆菌属3型和13TU型是主要病原菌，常引起重症监护病房患者的呼吸机相关性肺炎、皮肤和软组织感染、创面感染、泌尿系统感染、继发性脑膜炎和败血症[1]。鲍曼不动杆菌、不动杆菌属3型和13TU型等临床相关菌株与环境菌株醋酸钙不动杆菌具有高度相似的生化和遗传表型，在临床诊断实验室常难以区分，因而被统称为醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体（A. calcoaceticus�A. baumannii complex，Acb complex）[2]。不动杆菌属3型、13TU型在临床上相对少见，但这可能与VITEK等临床常用菌种鉴定系统不能将其与鲍曼不动杆菌进行鉴别有关。醋酸钙不动杆菌是环境菌株，而非临床致病株；其他不动杆菌也少见于临床样本，一般认为毒性较低。约翰逊不动杆菌（A.johnsonii）、琼氏不动杆菌（A.junii）、鲁菲不动杆菌（A. lwoffii）等偶可引起散发医院内感染，多与有创性置管治疗有关且大多预后较好[3]。 　　与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）等广泛传播病原菌的流行病学特征相似，鲍曼不动杆菌的流行病学特征包括：单克隆传播倾向、常引起医院获得性感染、多具有多重耐药特征。鲍曼不动杆菌常引起区域性暴发性院内感染[4-7]。其在医院内传播的主要途径是：接触被污染的医疗环境；接触未做好安全防护的医护人员。鲍曼不动杆菌感染的危险因素亦与其他多重耐药病原菌相似[8]。宿主因素为：重大手术、包括烧伤在内的严重创伤、早产儿。暴露因素包括：居住重症监护病房、住院时间、居住鲍曼不动杆菌曾经流行的病房、接触被污染的医疗设备。治疗相关因素包括：机械通气；静脉置管、尿路置管、体腔引流等置管相关治疗；多次有创操作和抗生素治疗史。 　　目前医院暴发性感染常发生于重症监护病房，而鲍曼不动杆菌是主要病原体，而重症监护病房大量使用的抗生素起到了对多重耐药菌株的选择作用。近年来临床分离鲍曼杆菌的多重耐药率逐年稳步上升，且近年来碳青霉烯类抗生素的耐药率也明显提高，部分菌株甚至对多粘菌素、替佳环素等不常用或新开发抗生素也产生了明显耐药性[1, 9-11]。现有研究证明，鲍曼不动杆菌的多重耐药菌株和抗生素敏感菌株在耐干燥和耐消毒剂、生物被膜、人类细胞黏附能力方面并无明显区别，因而多重耐药可能是流行克隆的主要特征[12-14]。 　　细菌克隆是指分离自不同时期不同地区，但具有相同的生物特征，因而可能来自同一祖先的菌株。在漫长的传播过程中，同一细菌克隆可能衍生出具有细微生物特征差别的亚克隆。基于扩增片段长度多态性（AFLP）和脉冲场凝胶电泳（PFGE）的分子分型技术研究结果都提示：与其他广泛流行的病原菌类似，鲍曼不动杆菌在不同国家的暴发性流行都由有限的几个克隆引发，而非大量克隆的同时播散[5-20]。基于细胞封套蛋白谱、核糖体分型和AFLP指纹的研究首次证实了欧洲1型和2型克隆的存在[4]。此后不久，欧洲3型克隆亦被报道[7]。目前已知以上3个克隆的流行区域不仅限于欧洲，而是在世界范围内广泛传播，其流行区域也包括亚洲和中国[21]。 　　2 鲍曼不动杆菌的常见分型方法 　　1986年，Bouvet等建立了基于菌株生化表型的不动杆菌分类系统[22]。随后，Gerner-Smidt等于1991年将该系统进行了进一步简化，使其更加实用[2]。此后发展起来的多种基于遗传表型的分型方法可更准确地对不动杆菌进行鉴定。目前为止，不动杆菌属可分为33型，其中17型已得到正式命名。 　　目前可用于不动杆菌分子分型的技术有核糖体基因分型、AFLP、PFGE、MLST等，其中核糖体基因分型、AFLP、PCR/ESI-MS还能用于菌属鉴定。现分述如下： 　　2.1 质粒分析。大部分不动杆菌都含有质粒，其中部分与耐药性及耐重金属杀灭作用有关[23-26]。质粒分析是最早应用于鲍曼不动杆菌分子分型的技术[27-29]，目前亦成功应用于其他不动杆菌的分子分型[30-32]。但该技术的缺陷也很明显：质粒易于在菌株之间传递，因而该分型方法的可靠性有限。 　　2.2 核糖体基因分型。核糖体基因分型可用于不动杆菌菌属鉴定，尤其是醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体的菌属鉴定[33-35]。早先使用EcoRI、ClaI、SalI等限制性内切酶的核糖体分型技术操作繁琐，且精确度低于PFGE[36, 37]。后来开发的使用HindIII/HincII等限制性内切酶的核糖体分型技术，其精确度已与AFLP相当。近来出现的自动核糖体基因分型仪的精确度类似于PFGE且耗时少；但自动技术花费较大，只有少数研究机构才有能力购置[37-39]。 　　2.3 脉冲场凝胶电泳。PFGE目前仍是大部分菌属的标准分子分型技术，小样本的研究也显示PFGE和AFLP的精确度相似[7, 37]；但该方法操作繁琐且耗时较长，无法大量推广。 　　2.4 AFLP。可同时应用于不动杆菌的菌属鉴定和分子分型[4, 40, 41]。AFLP目前已成功应用于鲍曼不动杆菌暴发性感染的分子流行病学研究[7, 15, 16, 42]，并最早推断出欧洲I、II、III型3个流行克隆的存在[7, 34, 43]。2000年，Leiden大学医学中心建立了包括2000多株菌株的AFLP数据库，为AFLP的进一步推广打下了基础。但该方法对技术的要求较高，在分析条带型时也需要大量的经验，因而只适用于少数大型研究机构。此外该方法的一个重要缺陷是重复性受外界因素的影响较大，不同实验室之间的研究结果无法比较。 　　2.5 MLST。MLST是一种通过对多个管家基因的部分DNA序列测序来发现菌株变异的分型方法。MLST一般测定7个管家基因内部的部分DNA序列，根据每一序列的序列特异性赋予一个特定的等位基因编号，每一菌株7个管家基因的7个特异性编号即构成该菌株的序列型（sequence type，ST）。MLST的分辨力接近于PFGE和AFLP，并已成功应用于多种菌属[44-47]，但花费较大且操作繁琐，不适用于鲍曼不动杆菌暴发性感染的临床检测。该方法的明显优势在于可比较不同来源菌株的亲缘关系并用于分子流行病学的研究。目前已有多种MLST分型技术应用于鲍曼不动杆菌的研究[48-51]，但这些技术因为未能结合鲍曼不动杆菌特有的遗传结构，因而仍然无法揭示流行克隆的内在遗传特征。　　2.6 PCR/ESI-MS。可用于不动杆菌的菌属鉴定，也可将鲍曼不动杆菌、不动杆菌3型、13Tu型区别开来[48]。该方法的优点是实验时间短，4小时即可。但其可靠性还有待进一步分析。 　　综上所述，质粒分析分型可靠性差，核糖体基因分型分辨率较低；而AFLP、PFGE等指纹分型技术只能提供有限的遗传进化信息、各实验室使用的操作规程及阈值存在差异、实验室之间的结果无法比较、无法排除菌株亚型的干扰，因而在分子流行病方面的应用有限。现有的多种鲍曼不动杆菌MLST分型技术亦无法揭示流行克隆的遗传特征。 　　3 基于最小生成树分析的MLST分型技术 　　目前已知发生于世界不同地区的鲍曼不动杆菌暴发性感染与都与欧洲1型、2型和3型克隆有关，但对其他不动杆菌的遗传差异及进化相关性却知之甚少。2010年4月，法国巴斯德研究所为主导的多个团队，共同建立了一个鲍曼不动杆菌MLST分型系统，试图解决这一难题[52]。该研究搜集了遗传背景尽可能多样化的不动杆菌属菌株作为研究对象，其中最主要的是123株AFLP指纹谱完全不同的临床分离菌株（含48株医院暴发性感染相关菌株）。此外还包括15株与鲍曼不动杆菌遗传表型高度相似的不动杆菌属3型、13TU型、醋酸钙不动杆菌和4株其他不动杆菌属菌株。 　　基于最小生成树分析（Minimum spanning tree analysis）的MLST分型系统的分析表明：鲍曼不动杆菌的进化与其他广泛播散的感染性病原菌的树形进化不同，表现为菌株之间遗传差异相对较小的星形进化，这可能与鲍曼不动杆菌近期进化过程中曾经存在一个比较严重的进化瓶颈有关。同时，鲍曼不动杆菌与醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体其他菌株，也并非如此前所知的那样具有高度的遗传表型相似性，而是存在较明显的遗传差异。目前该MLST系统已可成功地对欧洲1型、2型和3型三个已知流行克隆进行鉴定，并可用于描述鲍曼不动杆菌菌株之间的亲缘关系。 　　这一MLST分型系统目前报道了5个克隆复合体，其中克隆复合体1、2和3分别对应欧洲1、2和3型克隆[52]。1型克隆复合体又包含了1、7、8、19和20型共5个序列型。其中序列7、8、19和20型相互之间各存在2个核苷酸的序列差异，但与序列1型却都仅有一个核苷酸的序列差异，因而序列1型被认为是1型克隆复合体的遗传起源，而其他各序列型都是由序列1型进化而来。2型克隆复合体包含2、45和47共3个序列型。序列45和47型与序列2型在管家基因fusA上存在序列差异，因而序列2型是2型克隆复合体的遗传起源。3型克隆复合体则包含序列3和14型。 　　AFLP、PFGE等分型技术目前已广泛应用于多种病原菌的分子流行学研究[15-20]，但这些指纹谱分型技术提供的遗传信息过于庞杂，无法排除流行克隆菌株在播散过程中产生的克隆亚型的干扰，因而提供的信息有限。该研究表明：这一MLST分型系统与AFLP相似性80%为分型界值的敏感性相似，而较相似性90%为界值的AFLP分型方法敏感性更低[52]。因而该分型方法在准确鉴定鲍曼不动杆菌克隆特异性的同时，还可避免遗传指纹谱分型方法因敏感性过高而将克隆亚型错误鉴定为克隆型的缺陷。 　　综上所述，分子流行病学的主要研究内容是鉴定不同暴发性感染的病原菌是否来自同一克隆，分子分型技术可用于追溯不同医院、不同城市、不同国家、甚至不同大陆暴发性感染的来源，包括MLST在内的新型分子分型技术的出现，将为研究多重耐药鲍曼不动杆菌的流行机制提供重要的依据。 　　 　　参考文献： 　　[1] Dijkshoorn L, Nemec A, Seifert H. 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