磁性纳米颗粒Fe3O4固定化纤维素酶的光谱学研究
时间：2021-01-31 12:01:58 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
摘 要：本文主要进行纤维素酶的固定化研究。使用氨水沉淀剂，磁性微粒Fe3O4采用共沉淀的方法制备，并作为载体对纤维素酶进行固定化，多次重复试验以及傅里叶红外验证了纤维素酶在该载体上的固定，采用投射电镜观测了固定化酶颗粒的粒径也外貌，还研究了酶的活性，固定化纤维素酶最佳的活性在pH值为3.94～5.50左右，制备的固定化纤维素酶具有较好的存储性、热稳定性以及PH值的宽泛性，本文为纤维素酶的开发和利用提供了一条新的研究途径。
关键词：磁性纳米颗粒Fe3O4；固定化；纤维素酶；光谱学
前言
植物的主要组成部分之一就是纤维素，其含量约占植物干重的35%-50%，纤维素是世界上最广泛分布的天然碳水化合物，据估计每年世界纤维素的产量达4×106万吨。我国每年都会产生大量的植物，其蕴含的纤维素资源十分丰富，仅在农作物秸秆和植物皮核中蕴含的纤维素就有4亿多吨，林业采伐与加工的剩余物中也蕴含有1000多万吨的纤维素。有效的开发利用植物中的纤维素具有十分重要的意义，能够有效的缓解能源危机、环境污染、节能减排及粮食短缺等问题。而目前对纤维素的利用总量还不到世界产量的0.5%，大量的纤维素资源还没有得到有效、合理和广泛的应用。目前对纤维素资源的开发利用已经成为世界上许多国家研究和开发的重点，而纤维素酶是纤维素开发利用的重要方向之一，已经成为纤维素开发利用的重要途径之一。
目前，主要阻碍纤维素酶发展的障碍之一就是纤维素酶的酶解效率低下，纤维素是纤维素酶的底物，是不溶于水的，因此人们设计对纤维素的具有一定活性的来进行固化的酶的很困难的。而纳米材料具有小尺寸效应、量子尺寸的效应、表面效应、宏观量子隧道效应等特性，在许多领域都具有广阔的应用前景，如光吸收、催化、医药、激光、新材料、磁介质等。伴随着的纳米技术的发展，光谱学正在成为研究纳米材料的重要手段。本文的研究重点是利用氨水作为沉淀剂，采用共沉淀的方式来制备具有磁性的纳米材料，以磁性的纳米材料为载体，制备了固定化的纤维素酶，经过多次的重复性实验以及傅里叶红外的方法验证了纤维素酶在磁性的纳米材料上具有固定性，利用投射电镜的方式表征了固定化的纤维素酶形貌，纤维素酶的活性则采用DNS分光光度法测量，并且进行了纤维素酶最佳催化的PH值以及温度。研究结果表明该具有磁性的纤维素酶具有较好的存储稳定性以及热稳定性，提供了一条纤维素酶利用以及转化的新途径。
1 实验
1.1 实验仪器
分析纯的化学试剂有：无水乙醇、氨水、醋酸、硫酸亚铁、羧甲基纤维素钠、三氯化铁、醋酸钠、磷酸二氢钠、酸磷酸氢二钠等，来源于国药集团化学试剂有限公司。使用的纤维素酶是生物制剂，来源于立业生物公司。所用水均为去离子水。红外光谱采用Nicolet仪器公司的傅里叶红外光谱仪，透射电子显微镜为日本HITACHI公司，还使用到紫外-可见分光光度计（1cm石英比色皿）Cary250，来自Varian有限公司。
1.2 磁性材料制备
将摩尔比为1：2的FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O溶于蒸馏水，铁离子浓度为0.3mol/l。放入烧瓶之中，持续通入氮气，在快速搅拌的同时加入氨水，同时pH值保持在10左右。所得产物80℃下进行保温30min，以达到产物陈化。再将所得物用蒸馏水多次清洗，除去杂质。将所得的磁性颗粒存放于pH为9左右的环境之中。
1.3 固定纤维素酶
将磁性的纳米材料20～40mg，添加醋酸盐缓冲液（pH4.55，含0.1mol/lNaCl）1ml以及CDI溶液（0.03g/ml缓冲液）0.5ml，进行超声10min。再加入纤维素酶溶液（1.4～2.0mg/ml缓冲液）2.5ml，4℃进行超声30min。在具有磁场的环境下放置1～2min，再将磁性微粒和溶液进行分离，再使用缓冲液多次清洗磁性微粒。
2 结果与分析
2.1 磁性纳米材料的形貌表征
使用透射电镜（TEM）观测纳米材料进行酶固定化前后的粒径和外貌，固定的纤维素酶前后的TEM照片如图1所示。
通过图1可知采用共沉淀方法所得的磁性微粒粒径20nm左右，微粒分布均匀。将纤维素酶进行固定后，微粒的外貌基本没有改变，粒径变化也不大，这就表明在纤维素酶的固定过程之中没有破坏微粒的粒径以及外貌，主要原因是酶只在微粒的表面进行固定。
2.2 红外光谱研究磁性纳米微粒
取少量纤维素酶、磁性微粒以及固定化的纤维素酶已经定量的KBr进行混合，磨碎压片，使用傅里叶红外仪进行测定其红外光谱见图2所示。
图2傅里叶红外光谱
从图中可以看出（a）和（b）在580cm-1处出现特征峰，说明酶固定化后对磁性纳米微粒本身没有影响。（b）在1094cm-1处也出现特征峰，说明存在有组氨酸和铁配位基，同时说明可以通过配位实现纤维素酶在磁性纳米颗粒上的固定。此外，（a）在1625cm-1处有NH2吸收的特征峰，而（b）该特征峰变弱，所以Fe3O4上的氨基与CDI活化后的位于纤维素酶之上的羟基进行反应也可能对纤维素酶进行固定。
2.3 固定化酶影响因素
2.3.1 固定时间：使用试管四支，添加同质量的Fe3O4、纤维素酶、CDI以及缓冲液，进行超声15、30、45和60min，再进行酶的活性测定，发现酶的活性没有变化，表明15min已经将酶进行固定。
2.3.2 CDI用量：使用试管四支，添加同质量的Fe3O4以及缓冲液，改变CDI的浓度，0～4℃的温度内进行超声得到不同活性的酶，结果如表1所示，其中固定酶活以每克载体所具有的活力表示。
表1 CDI的浓度对固定酶活性的影响
由此可知，固定化酶的最佳活性在CDI浓度3.75mg/ml左右。
2.3.3 pH值的影响：保持其他条件相同的情况下改变缓冲液PH值，发现PH值在4.5-5.2时的效果最好。
3 结束语
以氨水作为沉淀剂，采用共沉淀的方式来制备具有磁性的纳米材料，以磁性的纳米材料为载体，制备的固定化的纤维素酶，具有较好的存储性、热稳定性以及PH值的宽泛性。此种方法为纤维素酶的开发和利用提供了新的研究思路，属于纤维素酶未来研究和发展的重要方向之一。
参考文献
[1]王玫，王芳，汪世龙，等.磁性纳米颗粒Fe3O4固定化纤维素酶的光谱学研究[J].光谱学与光谱分析，2006，26（5）：895-898.
[2]陈洪章.纤维素生物技术[M].北京：化学工业出版社，2005.
