半枝莲提取物 [半枝莲醇提取物对CCl4诱导的肝纤维化大鼠模型肝星状细胞凋亡的影响]

时间：2019-05-06 03:30:02　来源：雅意学习网本文已影响人

　　【摘要】目的观察半枝莲醇提取物对肝纤维化大鼠肝组织中肝星状细胞凋亡的影响，从细胞凋亡的角度探讨本药治疗肝纤维化的作用机理。方法将72只Wistar雄性大鼠随机分为正常组10只、观察组62只，建立大鼠肝纤维化模型，4周后造模成功，分别予生理盐水、半枝莲醇提物溶液大、中、小剂量及秋水仙碱灌胃，每天1次；12周末观察处死大鼠肝组织病变结构，并通过免疫组化TUNEL、а-SMA双标记检测实验大鼠肝星状细胞的凋亡情况。结果半枝莲醇提物能影响活化肝星状细胞的凋亡，改善肝组织的纤维化程度。结论半枝莲醇提物有一定的抗大鼠肝纤维化作用，其作用机制是通过诱导星状细胞凋亡来实现的。
　　【关键词】半枝莲；大鼠；肝星状细胞；细胞凋亡
　　肝纤维化是指肝脏纤维组织过度沉积，是纤维增生和分解不平衡的病理结果。反复或持续的慢性肝实质炎症、坏死，使其细胞外基质（extracellular matrix，ECM）合成过多的胶原纤维而导致降解不足从而形成肝纤维化，它是肝硬化的必经阶段［1］。肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）目前被公认为是ECM的主要来源细胞，HSC的激活是肝纤维化形成初始的中心环节［2］。所以，研究HSC的激活对探索肝纤维化发生机理及肝纤维化的有效预防均有特别重要的现实意义。因此，本实验在前期研究的基础上，从细胞凋亡的角度探讨半枝莲醇提物治疗肝纤维化的作用机理。具体实验报道如下：1 实验材料与方法
　　1.1 实验动物健康清洁级雄性Wistar大鼠72只（购于广西医科大学动物实验中心，动物许可证号：2008-001x），体重为180-220g，随机取2只作为正常组。剩余大鼠进行肝纤维化造模，在第4周末随机处死2只，实验结束时死亡8只，经检查证实肝纤维化形成后，将其余60只肝纤维化大鼠随机分为正常组、模型组、半枝莲醇提物溶液大、中、小剂量组和秋水仙碱西药对照组共6个组，每组10只。
　　1.2 造模方法参照韩德五等的实验文献报道［3］并加以改良，采用CCl4复合因素制备大鼠肝纤维化模型，采用高脂低蛋白食物(饲料用玉米面加入0.5%的胆固醇，在实验的第1-2周加20%的花生油饲养，配置10%酒精为唯一饮用水，第1次给CCl40.5mL/100g体重皮下注射，以后每隔3天皮下注射一次40%CCl4-油剂0.3mL/100g体重，2次/周，共6周。为了防止肝脏自然修复对实验结果的影响，各实验组于用药开始后仍注射40%CCl4-油剂0.3mL/100g体重，1次/周。
　　1.3 给药方法正常组给予普通饲料喂养，4周后以等容积的生理盐水灌胃；模型组在造模4周后，治疗组给予等体积的生理盐水、大、中、小剂量半枝莲（将半枝莲粉碎，准确称量后加入10倍量的乙醇，浸泡60min，乙醇提取3次，每次120min，浓缩至无醇味后真空干燥，准确称量干燥物1g/100g、0.5g/100g和0.25g/100g体重和秋水仙碱10μg/100g体重灌胃。以上各组灌胃液体量均为1mL/100g体重，每日1次，共12周。
　　1.4 肝组织HSC凋亡的检测用药12周后，各实验组大鼠禁食12/h后称重，采取颈椎脱臼法处死大鼠，剖取大鼠肝脏，用10%的甲醛固定，石蜡包埋、切片，行HE染色，在光镜下观察；取肝组织，采用免疫组化（TUNEL和α-SMA）双标记法检测，即肝组织石蜡切片常规脱蜡至水；0.01mol/L枸橼酸缓冲液微波修复3min，冷却后PBS洗；30%H2O2室温孵育5-10min，蒸馏水冲洗，将PBS浸泡5min；与5μl的Enzyme solution相混合，每片加入该混合物50μl，放置入湿盒内孵育60min，用PBS反复冲洗5min，连续3次；滴加TUNEL反应液50μl/片，37℃1h，取出置入PBS中洗5min，共3次；DAB显色，PBS洗5min，共3次，5%BSA封闭液室温孵育30min；倒去血清；滴加稀释的一抗(兔抗α-SMA，1：25)，37℃孵育1.5h，30min，PBS冲洗；滴加二抗（羊抗α-SMA，1：25。抗体购自北京中杉试剂公司），孵育30min（37℃），PBS反复冲洗；滴加SABC，孵育30min（37℃），再次用PBS冲洗；用DAB方法显色，苏木素轻度复染、封片。每片随机取5个400倍的高倍视野下观察，计数凋亡的细胞数目。阳性结果判定方法：每组随机选出5张做成切片，以HSC表达阳性细胞做为计数对象，其中胞质为黄染、胞核呈棕黑色，固缩和变形者为凋亡的HSC。
　　1.5 统计学处理各组数据以 χ±s表示。统计学处理采用SPSS11.0统计软件，多组数据间的比较采用单因素方差分析，以P 　　
　　表1 各组大鼠肝星状细胞凋亡（χ±s）情况比较
　　
　　组别 n 凋亡HSC(个/s400倍镜野）
　　正常组 10 0
　　模型组 10 0.24.±0.02①
　　半枝莲小剂量组 10 0.32±0.04①②
　　半枝莲中剂量组 10 0.36±0.05①②③
　　半枝莲大剂量组 10 0.39±0.01①②③
　　秋水仙碱对照组 10 0.31±0.07①②
　　注：与正常组比较①P

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