生物传感器测定农药类污染物2，4—D的检测方法研究

时间：2021-02-06 04:00:48　来源：雅意学习网本文已影响人

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　　摘要：平面波导型荧光免疫传感器（PWFI）是一种基于全内反射荧光和免疫分析原理的具有高灵敏度的生物传感器。本研究基于PWFI传感器，利用间接免疫反应原理，实现了对农药类小分子污染物2，4-D的检测，建立了运用PWFI传感器测定农药类小分子污染物的检测方法。为水环境保护和突发性污染事故应急监测等提供快速、简便、有效的技术支持。
　　关键词：生物传感器；检测；污染物；农药
　　Abstract： The Planar Waveguide Florescence Immuno-sensor （PWFI） is a kind of high sensitive bio-sensor which based on the principles of Total Internal Reflection Fluorescence and Immunoassay. This paper introduces to establish a detection method of small molecules pesticide pollutant-2，4-D by using PWFI bio-sensor. This method can be used to the rapid detection and early warning of pesticide pollutions as a support to the protection of water environment.
　　农药在人类的农业生产中为防治病虫草害发挥了重要的作用，但也带来了环境污染问题。农药是化学药品中毒性较高，降解缓慢的物质，经过长期积累、富集、迁移、转化，在大气、水体、食物链等介质中扩散传递，使环境空气、环境水体、环境土壤和食物都受到不同程度的污染，危害人类健康。何光好于1998年对全国109，700km河流进行的评价结果表明有70.6%的河流受到农药的污染[1]。大量研究结果显示，长江、黄河、湖泊、水库、海域等水体中均检出有毒有机污染物质[2]，有毒有机物引起的水环境污染问题已成为世界普遍关注的环境问题。
　　常用的微量有毒有机污染物检测技术主要有：气相色谱（GC）、高效液相色谱（HPLC）[3]、气液相质谱联用（GC-MC）等，这些技术能灵敏准确地检测各种不同环境样品中的有机污染物，但由于所用的仪器昂贵，使用环境要求较高，操作技术复杂，须由专业技术人员运行管理，维护成本高等，广泛普及应用于一般环境监测机构还有很大的局限性。另外，在检测过程中要求对样品进行复杂的预处理，耗时长，时效性差，不能满足环境污染事件现场应急监测的工作需要。生物传感器是一类基于生物分子与污染物的特异性反应对污染物进行识别，并通过光学或电化学方法获取信号的检测系统。近年，生物传感器的快速发展为其应用于环境中微量有毒有机物的检测展示了广阔的前景。本文介绍了基于平面物波导-荧光免疫生物传感器测定农药类污染物——2，4-D的检测方法研究。
　　1 实验仪器与材料
　　本研究采用了清华大学环境学院研发的平面波导型荧光免疫传感器系统，如图1所示。平面波导型荧光免疫传感器系统由光路系统、流动进样系统、信号处理系统三部分组成[4]。其中，光路系统主要包括激发光路和荧光收集光路；流动进样与反应系统主要包括免疫芯片、反应池、进样阀和微量计量泵；信号处理系统主要包括控制电路和信号处理电路。
　　试验材料包括：修饰后具有特异性反应点位的免疫芯片。Cy5.5标记的2，4-D抗体（研究组自备），抗体稀释液（研究组自备），2，4-二氯苯氧乙酸使用原液（2，4-D，Aldrich）（研究组自备），10mmol/L的PBS缓冲溶液，pH=1.9，浓度0.5%的SDS活化试剂，磷酸（H3PO4，分析纯），氯化钠（NaCl，分析纯），氯酸钾（KCl，分析纯），磷酸二氢钾（KH2PO4，分析纯），磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O，分析纯），超纯水。（注：所用试剂除购自Sigma的试剂外，其余试剂均为国内生产的分析纯试剂）。
　　2 免疫芯片的修饰
　　检测的核心元件是对2，4-D具有特异性免疫反应的生物芯片。因此，首先要对玻璃传感基片进行清洗和表面羟基化，然后将基片浸入2%的3-巯基丙基三甲氧基硅烷（MTS）溶液，在基片表面引入巯基，将巯基化的基片用无水甲醇清洗，吹干备用。将巯基化的基片浸没在0.002mol/L的N-琥珀酰胺基-4-马来酰胺-丁酸脂（GMBS）双功能试剂中（GMBS可与巯基和氨基发生反应），双功能试剂与基片表面结合，然后将15μl的2，4-D复合抗原溶液滴加于基片表面的检测点位上，在4℃冰箱内放置过夜以保证反应完全，经过反应形成对2，4-D具有特异性吸附的检测芯片。为了降低非特异性吸附对2，4-D检测的干扰，需要对芯片产生非特异性吸附的表面进行封闭。将清洗干净的上述芯片浸没于2mg/ml的BSA溶液中60min，反应完全后用高纯水冲洗干净，用氮气吹干。最后，在芯片垂直切面的一段0.5cm处涂上一薄层黑漆以吸收剩余的激发光。至此，2，4-D检测生物芯片制备完成。
　　3 数据分析方法
　　用平面波导型荧光免疫传感器检测农药类污染物2，4-D的方法，是建立在间接竞争模式基础上的，在本研究中，先将小分子配基固定到传感芯片上，然后将经荧光标记的抗体和待测样品中的抗原经过进样系统定量混合，使混合溶液预先预反应一段时间后，再将其通过进样系统输送到反应池进行反应，此时混合样品中剩余的带有荧光标记的抗体再与固定在传感芯片上的抗原结合，测定系统响应信号。在这种检测模式下，待测样品中的抗原越多，反应后剩余荧光标记抗体就会越少，能与固定传感芯片上的抗原结合的荧光标记抗体也就越少，系统的检测响应信号就越弱，反之信号就越强，两者间呈负相关系。标准曲线是进行数据分析的基础，也是实现定量关系的主要依据，同时也是验证检测方法的灵敏度的主要依据。在本研究中标准曲线是指描述检测信号值与抗原浓度的关系曲线，也称为剂量-效应曲线，检测方法的关键是在以上优化检测条件下，能够制作具有重复性的标准曲线，用以验证检测方法的灵敏性、准确性和重现性。

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