[Caspase-1在小鼠皮肤切创愈合过程中的规律性表达与损伤时间的关系研究]皮肤愈合过程
时间：2019-05-11 03:18:50 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
[摘要] 目的 观察小鼠皮肤切创后不同时间内caspase-1的蛋白含量变化，探讨不同时间点蛋白表达的规律与损伤时间的关系。 方法 建立3个组别。制作小鼠皮肤切创模型，应用免疫组织化学技术检测切创后不同时间皮肤中caspase-1的表达，同时设立空白对照组和死后切创组。 结果 空白对照组，死后损伤组及生前损伤组0 h的蛋白只表达在表皮层，毛囊，皮脂腺中。伤后3 h，切创组及切创周边区可见多核粒细胞浸润且少量多核粒细胞表达caspase-1。6 h~1 d，部分浸润的多核粒细胞和单核细胞caspase-1阳性。伤后3~5 d，成纤维细胞大量增生，此时caspase-1主要表现在单核细胞和成纤维细胞。伤后7 d则蛋白表达阳性细胞以成纤维细胞为主。 结论 小鼠切创愈合过程中caspase-1主要在多核粒细胞、单核细胞及成纤维细胞表达，并随损伤时间延长，呈现规律变化趋势。其时序性变化可用于皮肤切创损伤时间的推断。
[关键词] 法医病理学；皮肤切创；凋亡；Caspase-1；损伤时间
[中图分类号] R-33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2012）06（a）-0005-03
A study on the correlation between the wound age and time-dependent expressions of Caspase-1 during skin incised wound healing in mice
ZHANG Yi WANG Yingyuan▲
Department of Forensic Pathology, Shanxi Medical University School of Forensic Medicine, Taiyuan 030001, China
[Abstract] Objective To investigate the quantity contained protein expression caspase-1 in different time point after skin injury, which is attempted to explore the correlation between the wound age and the time-dependent expressions of caspase-1 during skin incised wounds healing in mice. Methods Established 3 groups. After model of the skin incised wound was established in mice, the expression of caspase-1 was detected by immunohistochemical methods. The uninjured mice group and mice which got post-mortem injuries were used as control group. Results There were no difference among the expressions of protein in control group, post-mortem injuries group and ante-mortem injuries at 0 hour group, which only can be detected in the epidermic cells, hair follicle epithelium and sebaceous gland epithelium. The positive cells were detected in PMNs in the wound specimens at 3 hours, and specimens aged from 6 h to 24 h after wound showed a large number of infiltrating PMNs and MNCs, from 3 d to 5 d post-injury, caspase-1 immunoreactivity was detected mainly in MNCs and FBCs. The positive cells was observed in FBCs aged 7 d. Conclusion We found that the caspase-1 positive cell ratios changes regularly as the injury time go on. The results suggest that casepase-1 may play an important role in inducing cells apoptosis during skin wound healing and as a maker for the wound age determination as MNCs, FBCs, PMNs expressed caspase-1 time-dependently during skin wound healing.
[Key words] Forensic pathology; Skin incisions; Pyroptosis; Caspase-1; Wound age determination
Caspase家族分为三大类，其中caspase-1属于炎症介导因子在介导炎症反应和死亡受体介导的细胞调亡途径中起辅助作用。 有研究证实，细胞凋亡相关斑点样蛋白（Apoptosis-specklike protein containing a CARD,ASC）和Caspase家族成员参与多种组织损伤和疾病中的细胞凋亡过程[1-3]。在炎症反应中，衔接蛋白ASC上调能介导caspase-1活化，加工炎症因子IL-1和IL-18使其成熟并释放。同时，caspase-1还能介导一种特殊的促炎症的程序性细胞死亡（Pyroptosis）[4]。目前尚未见关于皮肤切创中caspase-1的表达对细胞凋亡和组织愈合的影响与法医学损伤时间的推断的报道。本实验通过皮肤切创模型和免疫组化两步法研究皮肤损伤后caspase-1 的IHC表达情况，探讨其表达规律，推测皮肤损伤时间。 1 材料与方法
1.1 动物分组与模型的制备
健康成年昆明小鼠36只，雌雄不限，体重（30±3） g，随机平均分为3组，包括生前损伤组30只，死后损伤组3只，空白对照组3只。生前损伤组又分为10个亚组，根据于伤后0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d将小鼠颈椎脱臼处死分组，每组3只。死后损伤组为死后1 h后造模。10％的水合氯醛麻醉小鼠，按剂量0.004 mg/g体重腹腔注射。背部脱毛剂脱毛处理。常规手术消毒，在背部中央做一纵行长1.5 cm皮肤全层切口，深达筋膜。创面自然止血，不包扎不施药。切创后给予消毒饲料和双蒸水，保持伤口干燥，防止伤口感染。取伤口处及周边皮肤组织1.0 cm×1.5 cm，空白对照组小鼠不做切口处理，处死后取与损伤组小鼠相同部位大小相等的皮肤组织作为对照。死后损伤组小鼠处死后1 h造创，随后取皮肤组织。
1.2 主要试剂
两步法免疫组化检测试剂盒-SV系列（武汉博士德生物工程有限公司）；DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；兔抗小鼠caspase-1多克隆抗体（BA0586）（武汉博士德生物工程有限公司）；聚合HRP标记抗兔IgG二抗（武汉博士德生物工程有限公司）。
1.3 免疫组织化学染色
皮肤组织置于10％的中性甲醛/PBS固定液中及时固定24 h，石蜡包埋后3 μm厚度连续切片，贴于黏附载玻片，37℃温箱干燥过夜处理。采用Super Vision两步法免疫组化法，具体步骤同试剂盒说明。染色过程另以PBS代替一抗作为空白对照。
1.4 图像分析与数据处理
显微镜 400倍下, 在每张皮肤组织切片的损伤区中随机选择5个视野, 计数多核粒细胞（PMNs）、单核细胞（MNCs）及成纤维细胞（FBCs）的阳性细胞数及细胞总数。计算每个视野中阳性细胞数与上述3种细胞总数的比值。数据用x±s 表示。采用SPSS 11.0 for Windows软件包对数据进行方差分析。
2 结果
生前损伤组：3 h组开始有多核粒细胞浸润，阳性细胞百分比较低，之后随时间延长逐渐增多，12 h组大部分中性粒细胞呈阳性着色，1、2、3、5 d组多核粒细胞逐渐减少，成纤维细胞大量增生，阳性细胞主要为单核细胞和成纤维细胞，3 d组阳性细胞百分比达峰值，至第7天组阳性细胞百分比逐渐下降，以成纤维细胞为主，见表1，图1~4。经统计学方差分析，除0 h组外各相邻两时间组caspase-1阳性细胞百分比差异均有统计学意义（P ＜ 0.05），见表2。以PBS代替一抗，表皮，真皮及皮肤附属器未见明显非特异性染色。
空白对照组：小鼠表皮仅少量毛囊、皮脂腺、汗腺、部分血管内皮细胞呈caspase-1弱阳性表达。
死后损伤组：细胞表达结果与空白对照组相似。
表1 各损伤组细胞总数及caspase-1阳性细胞总数（x±s，n）
Table1 Total numbers of cells and caspase-1 positive cells at different post-incision intervals（x±s，n）
3讨论
本研究发现：在正常小鼠皮肤的表皮、毛囊、皮脂腺中有caspase-1表达；可能与其维持细胞稳态有关，在皮肤切创愈合过程中多核粒细胞，单核细胞及成纤维细胞表达caspase-1，提示caspase-1对引发此3种细胞的凋亡起重要作用[8]；caspase-1阳性细胞百分比的变化有时间规律性，提示其可作为法医实践中推测皮肤损伤时间的指标。本研究还对多核粒细胞、单核细胞、成纤维细胞及3种细胞总数及其阳性细胞数在皮肤损伤愈合过程中随时间的变化进行了统计分析，其结果符合客观规律。
本实验研究显示，伤后0~12 h浸润的多核粒细胞，单核细胞，成纤维细胞逐渐增多，提示机体防御系统已经启动，1~3 d光镜显示多核粒细胞明显减少，并可见单核细胞数量增加，成纤维细胞增生，说明组织通过单核/巨噬细胞的吞噬作用来清除过多的多核粒细胞，避免组织损伤。1~5 d的caspase-1阳性细胞率均在高值，但3 d组阳性细胞百分比最高，可能是多核粒细胞和单核细胞共同凋亡叠加[9-10]形成的高峰。伤后5 d处于单核细胞减少，成纤维细胞增生的阶段，细胞总数少，组织进入重建阶段，至第7天成纤维细胞增生达高峰。提示损伤修复过程加速。应用免疫组化方式推测损伤时间原理明确，结果可靠，是法医学损伤时间推测的趋势。皮肤损伤三阶段的划分，目的是为研究之便，并不能截然分开。炎症过程中也有细胞的增生现象，增生又与修复密不可分，多因子共同参与机制甚为复杂，caspase-1只是其中一个因子，需要注意的是，不同种类因子间复杂的关系有待于进一步研究。
Caspase-1是一种重要的与炎症性疾病和促炎症的程序性细胞死亡方式皆具相关性的因子[5-7]，应用已被证实可靠明确的免疫组织化学技术检测该因子在切创愈合的皮肤组织中时序性表达[11-12]，可望用于法医检案工作中参考。
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（收稿日期：2012-05-03 本文编辑：马双）
